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牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法

2010-7-28 22:49| 发布者: admin| 查看: 1689| 评论: 0|来自: 网络

摘要: 随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出,抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前,青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物,是牛奶中最常见的残留抗生素 ...

        随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出,抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前,青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物,是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则,出于经济利益的驱动,一些不法奶站为了谋求自己的经济利益,人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素,生产人造“无抗奶”。2005年至今,已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止,还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准,无法从源头上监测、把控原奶质量。
奶制品中三聚氰胺问题出现后,检科院按照国家局科技司的安排,对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作,初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶,它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的,可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性,导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高,从而大大降低了人们抵抗传染病的能力,给消费者的身体健康带来危害。
微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。
      

      微生物方法
 

1 材料
1.1 菌株 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001购自国家医学菌种保藏管理中心,在营养琼脂上传代培养备用。
1.2 培养基 营养琼脂培养基、抗生素检测用培养基Ⅱ(低PH)购自陆桥。
1.3 试剂 试验用10U青霉素药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司;舒巴坦、青霉素G、β-内酰胺酶标准品、生鲜牛乳抗生素分解剂、脱脂奶粉、生理盐水
1. 4 主要仪器 牛津杯(外径8mm)
2 方法
2.1 预试验
2.1.1 抗生素检测用培养基制备
90mm培养皿铺10ml抗生素检测用培养基Ⅱ(含1×108CFU/ml藤黄微球菌)。
2.1.2 生鲜牛乳抗生素分解剂活性分析
将10U青霉素药敏纸片均匀贴在抗生素检测用培养基表面,其中3片纸上滴加20ul不同稀释度的抗生素分解剂(500万U/ml,50万U/ml,5万U/ml),同时做生理盐水和青霉素药敏纸片对照。37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.3 青霉素G浓度的选择
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度(0IU/ml,0.005IU/ml,0.05IU/ml,0.5IU/ml,5IU/ml)青霉素G的生理盐水,37℃培养18-22小时。测量抑菌圈直径,以确定青霉素G使用浓度。
2.1.4 β-内酰胺酶对菌生长的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul含有不同浓度(0U/ml,4U/ml,40U/ml,400U/ml,50万U/ml,75万U/ml,125万U/ml,250万U/ml)β-内酰胺酶的生理盐水,37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
2.1.5 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G和不同浓度β-内酰胺酶(0U/ml,4U/ml,40U/ml,200U/ml,300U/ml,400U/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时。观察抑菌圈情况。
将不同稀释度的抗生素分解剂保存于4℃。10天后重复试验。
2.1.6 脱脂奶对实验效果的影响
使用10%(w/v)脱脂奶代替生理盐水重复2.1.3、2.1.4、2.1.5实验。观察实验结果。
2.1.7 舒巴坦浓度的选择(未完成,实验参数待验证)
有实验表明,在10%脱脂奶中添加12.5-800ug/ml舒巴坦进行测试发现,含有200ug/ml舒巴坦的脱脂奶在抗生素检测用培养基上不产生抑菌圈;含有25ug/ml舒巴坦可有效抑制10%脱脂奶中400U/mlβ-内酰胺酶对0.5ug/ml青霉素G的分解作用。
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同浓度舒巴坦(0ug/ml,100ug/ml,200ug/ml,400ug/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时。观察是否产生抑菌圈,以确定舒巴坦最高可适用浓度。
在青霉素G浓度(~0.5ug/ml)和舒巴坦最高适用浓度(~200ug/ml)确定的基础上,在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素G、400U/mlβ-内酰胺酶(高于推荐使用浓度100倍)和不同浓度舒巴坦(0ug/ml,25ug/ml,50ug/ml,100ug/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时。观察产生抑菌圈情况,以确定舒巴坦最终适用浓度。
2.1.8 脱脂奶中β-内酰胺酶的测定(未完成,实验参数待验证)
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶(添加成分见表1),37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。
表1
编号        0.5ug/ml青霉素G        400U/mlβ-内酰胺酶        25ug/ml舒巴坦        结果预测
(是否产生抑菌圈)
1        +        -        -        有
2        +        -        +        有
3        +        +        -        无
4        +        +        +        有
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶(添加成分见表1),37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。

2.1.9 β-内酰胺酶检测限的测定(未完成)
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有0.5ug/ml青霉素、25ug/ml舒巴坦和不同浓度β-内酰胺酶(0.4U/ml,4U/ml,40U/ml,400U/ml)的10%脱脂奶,37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。
2.2 牛奶样品中β-内酰胺酶的测定
在每个抗生素检测用培养基上平均放置4个牛津杯,在每个杯子中分别加入200ul添加有不同成分的10%脱脂奶(添加成分见表2),37℃培养18-22小时,观察抑菌圈情况。同时做脱脂奶中β-内酰胺酶的测定。
表2
编号        0.5ug/ml青霉素G        400U/mlβ-内酰胺酶        25ug/ml舒巴坦        抑菌圈        与1号比直径差异        结果预测
1        +        -        -        有                
2        +        -        +        有        ≥3mm
≤3mm        含β-内酰胺酶
不含β-内酰胺酶
3        +        +        -        无                
4        +        +        +        有                
5        -        -        +        无                
6        -        -        -        有/无                含抗生素/不含抗生素

3 实验结果与分析
3.1 预实验结果与分析
3.1.1 生鲜牛乳抗生素分解剂活性结果观察与分析

第一次实验 10天后第二次实验 青霉素对照
第一次实验5万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素,与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小;50万U/ml抗生素分解剂可以完全分解青霉素,不产生抑菌圈。
10天后第二次实验50万U/ml抗生素分解剂部分分解青霉素,与青霉素对照组比较抑菌圈明显变小。
第一次实验和第二次实验结果比较,抗生素分解剂活性下降至少1个数量级。

3.1.2 青霉素G浓度的选择

0.5IU/ml青霉素产生抑菌圈约为22mm,符合实验要求。

3.1.3 β-内酰胺酶对菌生长的影响

极高浓度β-内酰胺酶不影响菌生长。

3.1.4 β-内酰胺酶对青霉素抑菌效果的影响

第一次实验结果 10天后第二次实验结果
第一次实验中,4U/mlβ-内酰胺酶即可部分分解0.5IU/ml青霉素,与对照组比较抑菌圈明显减小。
10天后第二次实验,200U/mlβ-内酰胺酶可部分分解0.5IU/ml青霉素,与对照组比较抑菌圈明显减小。但4U/mlβ-内酰胺酶组产生的抑菌圈与对照组比较无明显区别。
通过第一次实验和第二次实验结果比较,说明抗生素分解剂活性下降。


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