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布鲁菌病血清学诊断抗原研究进展

2010-7-29 00:18| 发布者: admin| 查看: 1954| 评论: 0

摘要: (中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病重点开放实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,甘肃兰州 730046)摘 要:布鲁菌病的临床特征复杂而多变,病原的流行特点 ...

 

(中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病重点开放实验室,农业部兽医公共卫生重点开放实验室,甘肃兰州 730046)

摘 要:布鲁菌病的临床特征复杂而多变,病原的流行特点和免疫原性存在较大的差异,给人类及动物布鲁菌病诊断带了诸多的困难。目前常用的血清学诊断抗原如菌悬液,脂多糖等特异性差,敏感性低,制备涉及活菌的培养,不能广泛的应用,从而使患者和患畜得不到有效的治疗和预防。随着分子生物学技术的发展,基因重组蛋白可代替传统的抗原,为布鲁菌病的诊断带来了新的契机,文章从以上方面对可用于布鲁菌病诊断的抗原做了综述。

关键词:布鲁菌病;布鲁菌;血清学诊断;抗原 

布鲁菌病(Brucellosis)是布鲁菌(Brucella)感染引起世界范围内的重要的人兽共患病, 布鲁菌属有6个种,20个生物型,即牛种布鲁菌(B.abortus),含9个型;羊种布鲁菌(B.millitensis),含3个型;猪种布鲁菌(B.suis),含5个型;绵羊副睾种布鲁菌(B.ovis);沙林鼠种布鲁菌(B.neotomae) 和犬种布鲁菌(B.canis)[1]。其中感染人的有牛、羊、猪3个种,共17个型。它以无鞭毛、无质粒、有荚膜,并主要通过气溶胶感染后寄生于单核巨噬细胞内,破坏机体的免疫系统,给预防带来了很大的困难[2-3]。布鲁菌病在我国有着广泛的流行区域,根据国家疾病监控中心和农业部畜牧业疾病情报中心的报道,我国每年新发布鲁菌病的病例达几万人次,牛、羊、猪感染有百万头之多,所造成的经济损失可达十几亿元,更为严重的是布鲁菌发病近年呈上升趋势,不仅严重危害了人类的健康,而且对畜牧业生产造成极大的危害。长期以来,布鲁菌病作为国家法定的二类传染病得到人们的关注和重视[4]。布鲁菌感染动物其临床特征是生殖器官和胎膜发炎,引起流产、不育和各种组织的局部病灶。感染人其临床表现复杂而多变,易与上呼吸道感染、结核菌感染、病毒性肝炎、风湿病等相混淆,可引起低热、乏力、流产、不育、慢性关节炎和神经损害等,医生的误诊和病人的不及时治疗会使疾病转变为慢性,导致多个系统器官受累[5]。由于不同种之间布鲁菌的流行特点、免疫原性存在较大差异,且有交叉抗体存在以及人工免疫因素的影响,为布鲁菌病的正确诊断带来了诸多困难。因此,寻找优势抗原用于血清学诊断就显得至关重要。

1 血清学检测技术和选用抗原的现状

WrightSmith建立试管凝集反应(SAT)后,血清学检测技术得到快速的发展和改进,包括各种凝集反应、沉淀反应、补体结合反应(CFT)、试纸试验、标记抗体技术以及20世纪70年代发展起来的高灵敏度的酶联免疫吸附试验(ELISA)。而这几种血清学技术所选用的抗原也是不尽相同的。

1.1 菌悬液

菌悬液是试管凝集试验(SAT)、平板凝集试验(PAT)、虎红平板凝集试验(RBPT)中常用的抗原。其制备简单,将检定合格的菌种接种在肝琼脂斜面或其他适宜的培养基上,于37 ℃培养44 h48 h,经纯菌和变异菌检查合格后,用无菌生理盐水洗下菌苔,制成菌悬液,稀释成含菌25亿/mL50亿/mL即可[6]。虽具有较高诊断价值,但特异性不高,结果判定易发生漏诊。

1.2 脂多糖

脂多糖(LPS)是公认的刺激机体产生抗体的主要而有效的成分,制备时,可以通过用丁醇提取法获得布鲁菌脂多糖。在检测光滑型布鲁菌时,可以用孟加拉玫瑰红试验(rose bengal test)或血清凝集试验,发现LPS有很强的免疫原性[7]。国外有报道,用未纯化的S-LPS为包被抗原,采取间接ELISA法诊断羊群中布鲁菌的感染,可以有效地检测。但是它和其他菌以及同一菌的不同属之间存在共同抗原成分,无法区分疫苗株和自然感染产生的抗体,不能排除试验结果中假阳性的可能。

1.3 纯蛋白衍生物

可以用三乙醋酸和硫酸铵从布鲁菌液中提取获得,能尽量避免以前布鲁菌素中由于存在培养基成分、布鲁菌内毒素等杂质而引起的强烈机体超敏反应和有时出现的非特异性反应[8]。用纯蛋白衍化物作为胶体金免疫层析快速检测板(CGRST)包被抗原,用金标记protein A,利用间接法检测人和不同动物血液样品中的布鲁菌抗体,结果显示,CGRSTSAT检测的阳性符合率为100%[9]。虽然它的纯度高,毒副作用小,非特异性反应少,敏感性好,但不能排除与耶尔森菌O9型的血清学交叉反应。

上述3种抗原由于均直接采用布鲁菌菌体本身或提取培养物,生产与制备过程涉及活菌的培养,存在一定的生物安全危险,必须采取严格的生物安全措施,大大提高了生产制备的成本。因此,研究新型抗原迫在眉睫。

2 新型抗原

伴随着核酸疫苗、重组蛋白疫苗的发展,一些作为疫苗的后选抗原分子也相继被发现,如外膜蛋白(outer membrane protein OMPs)、细菌表面蛋白(Brucella cell surface protein BCSP)、核蛋白等。而它们也同样可以作为血清学诊断的候选抗原,加强布鲁菌病的临床诊断。

2.1 BP26

又名CP28或者OMP28,是一种具有强免疫原性的外周蛋白,还是一种可以由细胞内向外释放的可溶性蛋白,相对于固定的外膜蛋白来说,具有易于检出的优点。有报道显示,在牛、绵羊、山羊和人类的布鲁菌感染中都可以检测到BP26抗原的存在。使用BP26作为检测抗原,准确率可达90%以上[10]。另外,还发现在疫苗免疫的动物体内未发现抗BP26IgG,但是在80%H38株感染和89%自然感染的羊群中都可以检测到[11]。所以值得关注的是,BP26基因的表达在一些疫苗株中存在明显弱化甚至缺失的现象,这对于鉴别自然感染和疫苗接种具有现实的意义。此外,用纯化的BP26代替粗提蛋白做布鲁菌的诊断性抗原有以下优点:①BP26是其他可能干扰诊断试验的布鲁菌属抗原中游离出来的有效成分;获得重组的BP26蛋白耗时少且产量高;可以避免布鲁菌强毒株的培养及控制[12]

2.2 P39

P39是一种很好的T细胞抗原。在Rh?ne-Mérieux Lyon France制造的变应原中,P39蛋白是其中一种重要的组成成分。这种包含P39基因的布鲁菌变应原片段在动物体内能诱发强烈的迟发型免疫反应,诱发T细胞反应并产生IFN-γ[13]。在母牛中,用纯化的P39蛋白进行DTHlymphobla-stogenesis试验,证明了它的特异性和敏感性,他们对编码P39的基因进行克隆和测序,发现它在检测感染动物体液免疫和细胞免疫方面有重要意义。同时也指出纯化的P39蛋白是布鲁菌血清学诊断方面前景好的抗原[14],并可以与其他抗原如P15P17BP26联合,用于血清学诊断[15]。有人用P15-P39作为ELISA包被抗原,检测自然感染的绵羊和山羊的血清,检出率分别是80%96%,其敏感性强于细菌学检测和传统的血清学检测。但发现大部分DTH试验阳性的动物,在P15-P39ELISA中也表现为阳性。在自然感染的牛中,将P17-P39结合进行ELISA检测,检出率为60%。另外,还指出在试验感染的未孕动物和布鲁菌病低流行区动物中,ELISA检测的敏感性非常低,而在自然感染和布鲁菌病高发区,其敏感性很高。所以还可通过抗体滴度的不同,来区别天然免疫和自然感染,具有很强的诊断价值[14]

2.3 OMP31

OMP31蛋白为布鲁菌外膜蛋白,除了B.abortus天然缺乏编码OMP31蛋白的OMP31基因外,其他所有布鲁菌菌株都表达,Cassataro J[16]用重组OMP31为间接ELISA包被抗原,用人、羊和犬的血清检测的检出率为48%61%87%。在抗原性上具有较好的布鲁菌种属特异性。虽然从B.melitensis获取的重组OMP31蛋白在人和动物布鲁菌病中的诊断率不高,但是可以将OMP31和其他的重组蛋白联合使用,来进一步改进提高ELISA检测结果的敏感性和特异性。

2.4 OMP10

布鲁菌外膜蛋白OMP10属于菌体外膜的脂蛋白,是布鲁菌重要的免疫原性蛋白,存在于所有已知的布鲁菌的种和生物型之中[17-18],同时也被认为与布鲁菌的毒力密切相关。将OMP10BP26外膜蛋白联合应用于布鲁菌的血清学检测,不仅可以提高检测的敏感性和准确性,也能够区分自然感染和疫苗接种反应,具有非常好的应用前景[19]

2.5 17.3 ku蛋白基因

17.3 ku蛋白基因是Hemmen1995年发现的一个编码牛布鲁菌蛋白的基因,通过基因克隆和测序分析,发现在它的158氨基酸位置存在一个开放的读码框架,其编码的蛋白大小为17.3 ku。通过Western blot和竞争ELISA试验(用感染了羊或牛布鲁菌的动物血清)对它的抗原性进行了分析,发现它有很好的免疫反应性,可作为布鲁菌感染的血清学诊断抗原[20]

2.6 BCSP31

布鲁菌表面蛋白31(Brucella cell surface protein 31 ku BCSP31)基因于1988年被克隆测序和体外表达,它编码大小为31 ku、具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋白。该基因非常保守,在不同菌中的同源性高达99.3%,而且发现在布鲁菌基因组中去除这个基因,并不影响细菌的侵袭力和生长速度[21]。目前,分别用牛、羊、猪布鲁菌株DNA为模板扩增出的BCSP31基因,成功构建了重组表达质粒,并通过原核系统表达,经Western blot证实,该融合蛋白能被布鲁菌免疫的兔血清识别,有良好的反应原性,为研究新的检验方法提供了良好的基础。

2.7 L7/L12

L7/L12核蛋白为布鲁菌重要的免疫优势抗原,在布鲁菌各菌株中具有高度的保守性,它在布鲁菌的核糖体亚单位中以4个拷贝的形式存在,在细菌蛋白质合成过程中与延长因子相互作用。将成功表达后的融合蛋白L7/L12Western blot证实,发现它能被兔抗布鲁菌免疫血清识别[22]。在布鲁菌的几种保护性抗原中,以L7/L12为基础构建的DNA疫苗对感染具有最显著的抵抗作用,试验证实用牛的毒株544攻击时,该苗免疫的小鼠体内可产生较高水平的抗体,可将其用于布鲁菌病的血清学诊断[23]

2.8 CuZn过氧化物歧化酶

布鲁菌铜锌过氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)是布鲁菌的毒力因子,也是研究得较多的保护性抗原分子之一。有报道称研究人员用它构建的一种重组质粒,直接注射免疫小鼠,可诱导细胞免疫和体液免疫,还会引起T细胞增殖和干扰素的生成,用牛布鲁菌株2308来攻击免疫的小鼠,其产生的保护力等同于RB51免疫小鼠所产生的保护力保护力[24]。此外,构建重组体PBBSOD,用诱导后纯化的蛋白免疫小鼠,可获得较好的保护力[25]。说明CuZn过氧化物歧化酶具有好的免疫原性,并在小鼠体内产生免疫保护,可以用于布鲁菌病的血清学诊断的研究。

2.9 VirB12

VirB12与布鲁菌第四型分泌系统相关,编码VirB1-12位点,在布鲁菌感染的机体内复制并持续存在。包被纯化的VirB12蛋白,通过间接ELISA方法分别检测实验室感染的羊和小鼠,均能产生很强的抗原抗体反应。为了评价它的诊断效果,实验室用VirB12检测已知自然感染的牛群和健康牛群,结果显示出很好的阳性检出率和阴性符合率,因此VirB12是检测布鲁菌感染的一个很好的血清学指标[26]

2.10 TF

TF(trigger factor)属于分子伴侣,是一种新的保护性抗原。Yang X H首次将其构建成DNA疫苗,并注射小鼠,用布鲁菌16M攻击,发现小鼠体内可产生明显的保护(P0.011),经Western blot证实,其纯化蛋白可以被单克隆抗体识别。另外,他还指出,如果将TFBP26两种抗原进行联合,会产生更强的保护作用[12]。因此,TF同样可以作为羊布鲁菌病血清学诊断抗原。

3 结语

布鲁菌在人畜中感染的几率越来越高,尤其近几年养殖业的迅速发展,布鲁菌病的发病率出现回升。接种布鲁菌减毒活疫苗是我国临床上一直以来延用的预防手段,但因存在多次接种、非特异性免疫力下降、有致敏损伤等缺点,所以多用于高危人群[27]。目前研究的重组蛋白疫苗和亚单位疫苗,由于产生的免疫保护力低,选择目的基因不够理想等原因,还停留在实验室阶段。此外,布鲁菌病的临床症状不典型,容易误诊,延误病情[5]。而免疫学反应,不论是实验室常用的血清学测定,还是细胞免疫观察,或者培养进行细菌分离鉴定,所有方法都需要少则2 d3 d,多则1周~2周才能出结果,耽误治疗,给患者造成不必要的痛苦[9]。目前,临床布鲁菌检测的金标准是细菌学检测,此方法费时费力,不能做到早期快速诊断,而另一些血清学检测方法,采用的抗原敏感性低,特异性差,容易和其他种属细菌存在一定的抗原性交叉,易导致假阳性的发生,所以不能一次性确诊。因此,我们要努力在此检测方法的基础上做进一步的探索,利用生物技术研制安全廉价、敏感特异、能够代替菌体抗原的重组蛋白抗原,是提高血清学诊断所必须的。相信在不久的将来,新的布鲁菌病诊断试剂盒将用于临床并造福于人类。

 

参考文献(略)



收稿日期:2008-09-01

基金项目:国家支撑计划课题(2006BAD04A05)

作者简介:宫晓炜(1982),女,甘肃兰州人,硕士,主要从事动物传染病分子流行病学与免疫学研究。通讯作者


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