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我国布鲁氏菌病病原学诊断方法研究概况

2010-7-29 00:20| 发布者: admin| 查看: 1629| 评论: 0

摘要: 布氏菌病是难以分离培养和鉴定的细菌,正确的病原学诊断,可为布氏菌病的防治工作和疫区分类提供可靠的依据。随着科学技术的发展,经过多年的研究和探讨,已建立了多种布氏菌病病原学诊断方法,并已达到分子诊断水平 ...
      布氏菌病是难以分离培养和鉴定的细菌,正确的病原学诊断,可为布氏菌病的防治工作和疫区分类提供可靠的依据。随着科学技术的发展,经过多年的研究和探讨,已建立了多种布氏菌病病原学诊断方法,并已达到分子诊断水平。
   
    1  DNA G+C MOL%含量的测定及DNA同源性分析在布氏菌病病原学诊断中的应用
   
    郭秀兰利用热变形方法,对不同种布氏菌的DNA分子中G+C MOL%进行测定,证实布氏菌DNA分子中G+C含量非常相似(56.0%~58.0%)[1]。王晓英对传统的热变性温度法测Tm值加以改进,测得值与文献[1]相符[2]。吴从雅以液相复性速率分子杂交法测23株布氏菌及大肠杆菌K12、绿脓杆菌、痢疾杆菌、耶尔森氏菌O:9、鼠伤寒杆菌等5株对照菌及5株可疑布氏菌的DNA与布氏菌DNA杂交率。证实布氏菌属内细菌具有高度同源性[3]。而郭秀兰对6种不同型布氏菌做了同源性测定,证明布氏菌6个种不同型间DNA同源率82.7%~104.2%,是高度同源的[4]。利用热变性温度法测定布氏菌G+C含量和DNA杂交技术测定其同源性,不受菌龄、外环境变化的影响,且稳定、可靠、重复性好。为鉴定非典型及变异布氏菌提供了科学可靠的方法[5]。
   
    2  布氏菌外膜蛋白的研究
   
    布氏菌外膜蛋白分3大类,第1组分子量为88~94KD,第2组分子量为35~40KD,第3组分子量为25~30KD。武素怀等用两性离子去污剂从牛、羊、猪种布氏菌的光滑型、粗糙标准型、非典型株中提出了外膜蛋白。利用SDS-PAGE方法,对布氏菌外膜蛋白进行了研究,发现了布氏菌外膜蛋白的某些成分有非常相似的电泳带类型。其中微孔蛋白的三聚体及解聚后所形成的单体存在形式不同,反映在SDS-PAGE图谱上的带形具有种的特异性[6],这为布氏菌种间鉴定提供了一种新手段[7]。卿燕等报道,用布氏菌外膜蛋白抗原,对142份急、慢性期布氏菌病患者血清做免疫酶斑点试验。结果表明,敏感性、特异性和操作程序均优于ELISA,可供大量布氏菌病血清检查用。同时所采用的外膜蛋白抗原为诊断粗糙型及非典型布氏菌引起的布氏菌病提供了广谱抗原,用于布氏菌病的实验室诊断[8]。
   
    3  布氏菌染色体DNA的酶切分析
   
    用核酸限制性内切酶处理细菌DNA,所得片段的电泳图用以区别细菌的种,此法也被用于布氏菌的DNA分析[9]。唐浏英对布氏菌1330S、16M、544A染色体DAN最适酶切条件进行了研究,探讨了影响限制性内切酶对DNA消化的因素[10]。李元凯利用HindIII、BgII、EcoRI 3种酶对16M、544A和8株非典型布氏菌株的DNA片段进行消化,证明3种酶能将以上菌株切开,但非典型菌株之间、非典型菌株与标准菌株之间均未看出明显差别[11]。用核酸限制性内切酶图谱是不能区别布氏菌的种和型,或很难区别。
   
    4  单克隆抗体的制备及在布氏菌病病原学诊断中的应用
   
    鲁齐发等应用杂交瘤技术获得了两种抗布氏菌表面抗原A和M的单克隆抗体15及58。这两种抗体初步可对牛种与羊种布氏菌1型及其他一些生物型菌相鉴别[12]。同时还应用了犬种和绵羊附睾种布氏菌单克隆抗体对不同种型布氏菌株进行检测,证明两种单克隆抗体对粗糙型布氏菌有特异性,可用于粗糙型与光滑型布氏菌的鉴别,特别是采用ELISA对粗糙型布氏菌的确定,不仅可做定性或定量检测,而且敏感性明显高于凝集反应[13]。金根源等使用反向单克隆抗体酶联免疫法检测用布氏菌感染小鼠后1、3、6个月其脏器中抗原存在情况,同时分离细菌及作血清学检查。结果表明,反向单克隆抗体酶联免疫法检测抗原阳性高,并有较强的特异性,此法不但可以提示受感染者的保菌情况,并且比细菌分离法敏感等优点[14]。
   
    5  布氏菌染色体基因库的建立
   
    刘兴汉等采用PBR328载体,经过几轮工作后,建立了布氏菌强毒株M28染色体基因库,并对质粒载体和噬菌体载体作了比较。一质粒为载体构件染色体基因库,载体所能容纳的外来片段较小,需要建立较大的基因库,筛选工作繁重,同时外来DAN片段越小,切断有用基因的风险也越大,而用此方法一旦筛选出阳性克隆,有可能直接发展为诊断试剂和基因工程菌苗。布氏菌基因库的建立,为解决布氏菌病的诊断、治疗和预防以及消灭布氏菌病奠定了基础[15]。
   
    6  聚合酶链反应(PCR)在布氏菌病病原学诊断中的应用
   
    唐浏英等把PCR用于布氏菌的检测[16],所采用的引物序列是由编码牛种布氏菌36kD外膜蛋白基因序列设计的,两引物均为24bp,间隔180 bp。扩增了布氏菌牛、羊、猪、沙漠森林鼠、绵羊附睾、犬6个种的染色体DNA,均获得阳性扩增结果。李铁锋等[17]采用编码牛种布氏菌31KD外膜蛋白基因序列设计的,不同扩增片段的3对引物,对布氏菌DNA检测进行了实验研究。证明,通过此种方法可检测到小到1PG的布氏菌DNA。对布氏菌5个种的典型株进行DNA分析,并获得独有的相应片段。而两种与布氏菌SPP存在血清学交叉反应的革兰阴性细菌未检测到特异DNA片段。同时,王季秋等[18]采用上述3对引物对急、慢性期布氏菌病患者(50例)、健康人(45例)及感染布氏菌后的豚鼠全血进行检测。结果,42例急慢性期布氏菌病患者和5例健康人PCR试验为阳性,感染豚鼠全部阳性。PCR试验诊断布氏菌病病人具有较高的敏感性和一定的特异性,其应用前景较好。

【参考文献】

    1  郭秀兰.布鲁氏菌DNA的提取及G+C mol%测定的研究.中国地方病防治杂志,1987,2(增刊):9.
    2  王晓英.细菌DNA G+C mol%在布鲁氏菌种鉴定中的应用.中国地方病防治杂志,1992,7(2):95.
    3  吴从雅.布鲁氏菌DNA同源性研究报告.中华流行病学杂志,1989,10(特刊6):60.
    4  郭秀兰.应用细菌DNA同源性鉴定布氏菌.中国畜禽传染病,1990,5:9.
    5  李元凯.常规鉴定方法表现异常的布鲁氏菌非典型株的鉴定研究.中国八十年代布鲁氏菌病防治研究进展.北京:中国科学技术出版社,1991.
    6  伍素怀.布鲁氏菌外膜蛋白的研究.中国八十年代布鲁氏菌病防治研究进展.北京:中国科学技术出版社,1991.
    7  尚德秋.布鲁氏菌非典型菌株及R型菌株鉴定分类的研究.中国八十年代布鲁氏菌病防治研究进展.北京:中国科学技术出版社,1991.
    8  卿燕.用布鲁氏菌外膜蛋白抗原的免疫酶斑点试验检测布病患者的抗体.全国布病学术会议材料,1990.
    9  薛平.用现行DNA数据命名布氏菌的建议.地方病译丛,1987,6:15.
    10  唐浏英.布氏菌1330S、 16M 、544A染色体最适酶切条件的选择.中国地方病防治杂志,1992,7(4):209.
    11  李元凯.布鲁氏菌非典型菌株的分子生物学研究.中国地方病防治杂志,1997,12(6-A):8.
    12  鲁齐发.布鲁氏菌非典型菌株的分子生物学研究.全国布病学术会议材料,1990.
    13  鲁齐发.粗糙型布氏菌单克隆抗体的制备及应用于种型鉴定的实验报告.中国八十年代布鲁氏菌病防治研究进展.北京:中国科学技术出版社,1991.
    14  金根源.反向单克隆抗体斑点酶联免疫法检测布鲁氏菌病抗原的初步应用.全国布病学术会议材料,1990.
    15  刘兴汉.布鲁氏强毒株M28染色体基因库的构件.中国八十年代布鲁氏菌病防治研究进展.北京:中国科学技术出版社,1991.
    16  唐浏英.应用分子生物学技术检测布鲁氏菌抗原的研究.中国地方病防治杂志,1995,10(4):199.
    17  李铁锋.PCR检测布氏菌DNA的试验研究.中国地方病防治杂志,2002,17(4):211.
    18  王季秋.全血聚合酶链反应实验在诊断布氏菌病中的应用效果观察.中国地方病防治杂志,2003,18(1):10.


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