牛卵巢活动对超数排卵影响研究进展

摘　要：超数排卵在实际生产中提高了胚胎移植技术对单胎动物的繁殖率，但是，超数排卵的结果存在很大的差异性。影响超数排卵结果的因素有很多，如牛的自身因素，超数排卵方法的选择，所使用促性腺激素的种类，激素的质量，环境因素等。文章以牛自身卵巢活动对超数排卵的影响为出发点，综述了牛正常卵巢活动及卵泡活动对超数排卵影响的研究进展，包括卵泡波动力学，卵泡波发育过程中促性腺激素的作用；分析了卵巢对促卵泡素（FSH）及促黄体素(LH)的特异应答性机制，对各个卵泡波进行了比较，根据卵泡波动力学理论列举了几种切实可行的同步卵泡波的超排方法，对超数排卵结果差异性的原因做了补充说明。

关键词：卵泡波；超数排卵；牛

只有更好的了解卵巢的机能，才能有效地控制卵巢的活动。随着人们对黄体（corepus luteum，CL）作用相关知识和牛发情周期中有关卵泡波知识的深入了解，人们对同期发情和排卵的精确性做了进一步研究。在生产实践中，人们发现在牛的卵泡波出现时使用促性腺激素刺激，有利于超数排卵(超排)反应。使用控制卵泡波发育的方法，如卵泡切除，或使用孕酮/雌激素等，可降低超排处理时因卵泡所处时期不同而引起的差异性，并且同步卵泡波也可利用卵巢内源性的募集和选择机制来提高超排的反应性。同步卵泡波的超排方案不需观察发情期，有利于在自定的时间进行促性腺激素处理，而不影响超排效果。此方法可对供体牛间隔25 d~30 d后再行超排，无须考虑观察发情期或者发情周期所处的阶段，且并不影响胚胎的生产。

何时采取超排处理要考虑的一个重要因素是卵巢上是否存在优势卵泡，多数方法选择在发情排卵后的第1个或第2个卵泡波出现之前进行超排，目的就是为了避免优势卵泡对超排的影响。文章综述了牛的卵泡动力学研究的概况及其与超排反应的关系，为超排提供有价值的参考信息。

1　卵泡波动力学

一组获得对促性腺激素发生反应能力的卵泡，在相对集中的时间内同步生长，形成一个生长卵泡群体，称之为一个卵泡波，有超过95%的牛的卵巢周期是由2个或3个卵泡波组成^[1]。Adams G P^［2］报道，青壮年牛在青春期和成熟奶牛产犊到第1次排卵会有单一的卵泡波，印度瘤牛偶可发现有4个卵泡波的现象，关于2波周期和3波周期牛的比率，有人认为主要是以2波周期为主，也有人认为以3波周期为主。尽管在此方面还没有系统的研究，但在卵泡波的类型中还没有明显的品种和年龄的特异性，也没有明显的繁育力的差异^[3]。在营养对牛的卵泡波影响的研究中发现，饲喂低能量饲料的牛3波周期的比率较高，饲喂高能量饲料的牛2波周期比率较高^[4]。有数据初步表明，在个别动物中卵泡波的类型是可重复的。在对印度瘤牛的另一项研究中，发现25头牛中有4头牛每个周期有4个卵泡波，有1头牛春季是4个卵泡波，而到秋季变为3个卵泡波。对于2波周期或3波周期，或者波型结构本身的变化的原因尚不清楚，然而波型的不同是很显著的，并且它们对卵巢的同步和超排的影响也很复杂。

卵泡波发育的类型是与同一团卵泡同步的、周期性的生长有关。牛卵泡波的突然出现（1 d~2 d内）是以超过20个小卵泡的生长为特点的，开始时用超声探查可知卵泡直径为3 mm～4 mm^[2]。大约在2 d内，卵泡波中卵泡的生长是相似的，然后会有一个优势卵泡持续生长，其他的则会闭锁。有第2个和第3个卵泡波的牛，第1个卵泡波始终是在排卵日出现（第0天）。2波周期的牛，第2个卵泡波出现于第8天或第9天。3波周期的牛，第2个卵泡波也出现于第8或第9天，第3个卵泡波出现于第15天或第16天。连续的卵泡波可阻止排卵，直到黄体溶解。优势卵泡直到黄体溶解时才变成排卵卵泡，下一个卵泡波的出现将延迟到下一个排卵日。2波周期牛的黄体开始退化的时间（第16天）比3波周期牛的（第19天）早，并可导致相对较短的发情周期（分别是20 d和23 d）。因此，发情周期时间的长短为判断牛属于哪种卵泡波类型提供了一些线索。

2　卵泡波发育过程中促性腺激素的作用

2.1　卵巢对促卵泡素及促黄体素的特异性应答机制

循环中促卵泡素（FSH）浓度的周期性峰值引发了卵泡波的出现。因此，2波周期的牛周期中有2个FSH峰值，3波周期的牛周期中有3个FSH峰值^[5]。随后由卵泡分泌的雌二醇和抑制素的负反馈作用抑制了循环中的FSH，从而使FSH降至最低值而抑制了新的卵泡波出现。FSH的短暂性升高使一些卵泡充分生长，获得了对促黄体素（LH）的应答性，使卵泡在无FSH，只有LH的情况下能够生存。排卵过程是在LH峰的作用下开始的，这个过程中卵巢在生化、物理和基因表达方面发生了剧烈的变化，并最终导致卵泡破裂释放出卵母细胞，Mary C G^[6]报道卵泡破裂最终是由内皮缩血管肽2(EDN2)的刺激而引发，并指出EDN2在卵巢排卵前的颗粒细胞中有短暂的特异性的表达。卵泡选择性生长的时间为卵泡波出现后2 d～3 d，FSH迅速下降，获得LH表面受体的卵泡发育成优势卵泡，比其他的卵泡有竞争优势。然而，获得LH反应性的卵泡和成为优势卵泡的可能性只是表现为一种数量关系，与卵泡波中其他卵泡并没有完全不同。如果移去原有的优势卵泡或供给外源性FSH，则其他卵泡也会发育成优势卵泡^[2]。更重要的是同单一优势卵泡相比，较小直径的多个优势卵泡（如用FSH超排刺激）对LH的竟争能力与单个的优势卵泡相似。作为黄体期孕酮的继发作用，LH的持续抑制可引起优势卵泡的闭锁，然后使FSH再次升高。FSH峰并不影响即将闭锁的优势卵泡，但可引发下一次卵泡波的出现，然后卵巢周期周而复始。孕酮抑制减弱后（如黄体溶解）就会使LH脉冲频率增加，优势卵泡继续生长，循环中雌二醇浓度升高，LH峰出现，在LH峰后排卵。

常规进行诱发卵巢超排的时间是在发情周期的中期（发情后8 d~12 d），超排的效果较好。而在发情周期的后期（发情后9 d～10 d）和早期（发情后2 d～6 d）超排则效果较差^[6-7]。使用常规方法相对比较成功的原因可以通过卵泡动力学来解释。

在优势卵泡选择性生长之前进行诱导处理，超排的反应会更强烈些。在最初的研究中，若在优势卵泡选择性生长的时间（第1天，排卵是第0天）给予青壮年牛重组FSH（bFSH）处理，会比在优势卵泡选择性生长后（第5天）有更好的超排效果^[8]。Nasser L等^[9]指出，在内源性FSH浓度波动达峰值时给予外源性FSH会有利于超排反应。内源性FSH峰出现在卵泡^波出现的前1 d，因此超排处理要在卵泡波出现的当天或出现后的1 d～2 d进行。在卵泡波出现的当天或前1 d进行超排处理，可明显获得更好的超排效果。

2.2　不同卵泡波的比较

对各个卵泡波之间进行直接比较，在Rhodes J M等^[1]的一项研究中，对第1个卵泡波出现的当天和第2个卵泡波出现的当天的牛进行超排处理，超排反应没有明显的不同，与先前研究结果一致^[9]，当在卵泡波出现1 d以后进行超排处理，那么超排反应会降低。这些资料表明，当在第1个或第2个卵泡波中进行超排，可能会诱发同等效果的排卵反应，并且在卵泡波出现的当天进行处理，可以得到较好的排卵反应。?

根据优势卵泡在2波周期和3波周期生长发育的持续时间，在给定的时间里，2波周期的牛约有30％的优势卵泡失去功能性优势（在20 d中的6 d），3波的周期的牛约有35％的优势卵泡失去功能性优势（23 d中的8 d）。更重要的是，在整个发情周期中只有20％（4 d或5 d）可以在卵泡波出现的时间里进行诱导处理。因此，发情周期有80％的时间不是最佳进行诱发超排反应的时间。为了消除这个问题，可以使用选择性诱发卵泡波后进行超排来替代常规超排。

2.3　同步卵泡波的方法

为了使卵泡波出现的时间同步化，在发情期的任一时间，在超声波引导下进行卵泡消融术，然后在阴道内放置孕酮植入物，并在消融术1 d后进行Folltropin?V（加拿大产商品化FSH）处理。未消融处理的对照青壮年牛可以在发情后8 d~12 d进行Folltropin?V处理。综合两项实验，消融实验组和未进行消融实验组在超排反应上没有不同。在另一项研究中，Bungartz L等^[10]在进行促性腺激素处理的前2 d进行消融术处理可提高超排反应。还有研究表明，在发情周期的任意阶段对2个最大的卵泡进行消融可以保证移除优势卵泡并且在1 d～2  d后出现新的卵泡波。

同步卵泡波的另外一种超排方法，是在置入阴道孕酮埋植物后注射5 mg 17β雌二醇，在雌二醇处理的第4天开始进行Folltropin?V处理。对照组牛在发情后的8 d～12 d之间，给予同等剂量的Folltropin?V处理。综合两组实验，进行雌二醇处理组和对照组超排的效果相当。

超排同步化卵泡波最常用的方法是，在阴道栓CIDR?B置入时肌肉注射5 mg 17β?雌二醇和100 mg孕酮，然后在雌二醇处理4 d后开始进行单一剂量或者多剂量给予Folltropin　V^[11-12]。在给予Folltropin　V 48 h后给予PGF并在12 h后移除CIDR?B。综合几个实验，雌二醇处理组的超排反应等同于或者高于在周期的8 d～12 d进行超排的对照组。一些试验研究比较了卵泡波出现的同步性和含17β?雌二醇及戊酸雌二醇酯的诺孕酮移植物处理后超排的反应性^[13]。用17β-雌二醇处理了37头奶牛，卵泡波出现于第3天或第4天（平均?3.6 d），?用戊酸雌二醇酯处理的奶牛有68％其卵泡波在第3天和第6天之间出现（平均5.7 d），用17β?雌二醇处理组其超排反应和收集卵/胚胎总数也比较高。Caccia M等^[14]证明，用17β?雌二醇和孕酮处理，卵泡波出现的同步性更高，并有利于选择性诱导超排。在另一个研究中，在第4天用苯甲酸雌二醇1 mg的剂量同步化卵泡波的效果就相当于5 mg 17β雌二醇，然而一次剂量5 mg的苯甲酸雌二醇产生同步卵泡波的时间平均为5 d会导致更大的差异性。但还没有关于低剂量苯甲酸雌二醇对同步卵泡波的研究。在任一情况下，这些研究都表明，选择性诱发卵泡波出现有利于增加超排的反应性，也有助于卵泡的补充。因此，在整个发情周期都可进行超排处理，并且不用再观察发情期或排卵后再等8 d~12 d后才进行促性腺激素处理。

在超排刺激和同步卵泡波的研究中，使用一次快速注射Folltropin?V的反应效果明显优于多剂量给药。FSH波的最低浓度是阻止下一个卵泡波出现的原因，在FSH最低浓度阶段供给外源性FSH使小卵泡“突破性”生长，并诱发产生新的卵泡波（如用FSH抑制优势卵泡）^[2,8]。可用来解释常规超排处理中大剂量的外源性FSH是如何控制内源性节律和掩盖波动效应的。无论促性腺激素处理时卵泡波所处的阶段如何，如果超排刺激的时间足够久，那么卵泡募集作用将表现的很明显。然而，卵泡募集的非同步性，可导致卵巢卵泡反应、收集的卵和胚胎的数目及品质有很大差异性。

3　结语

总之，目前的研究表明，使用激素超排处理，并不能取得一致的预期效果。或许是由于供体母牛卵巢本身的生理状况差异，不可能用同一水平标准的激素处理来消除，这就提示人们，超排处理可以作为鉴定母牛卵巢潜在机能的指标之一。通过一次或几次超排处理，将结果与每个牛超排时的卵巢生理状况相比较，可以根据卵巢的大致状况及前次的超排效果将供体母牛分类处理。除了供体母牛的品种特性、个体差异外，即使是同一个体同一体积的卵泡对促性腺激素的反应也并不都是一样的。这些原因使得人们进行以“在一个卵泡波中出现更多的生长卵泡，尽可能整齐地排卵以及减少不受精率和变性胚胎数”为目的的试验和生产时，会出现并不完全一致的结果。当然，超排作为一种实用的高新技术，人们会通过进一步研究来完善和简化其程序。同时，对超排技术的研究也会使人们进一步弄清卵泡的募集、优势化和排卵或闭锁的机制，从而对牛的繁殖调控起到推动作用。