性别控制(Sex
Contro1)是通过人为干预使动物按人们所需性别繁衍后代的技术。自Guyer(1910)发现哺乳动物性染色体以及Welshonshe和Jacobs等(1959)提出Y染色体决定雄性的理论以来．人们对通过处理精子控制性别产生了极大兴趣
1925年Lush最早进行性别控制研究．用分离的兔X和Y精子授精。但后代的性比例无显著改变性别控制技术在畜牧生产中具有广阔应用前景．尤其是奶牛生产．雌犊价值高出雄犊数十倍乃至近百倍，而雄犊出生即被淘汰；若能人为控制多产雌犊。其经济价值不仅体现在雌犊本身．还节省怀雄犊母畜的饲料消耗
本文从精子水平和胚胎水平探讨奶牛性别控制的现状与生产中的发展应用等相关问题。
1 精子水平的性别控制
早期分离精子主要采用“物理分离法”。包括柱层析分离法、沉淀法、电泳法、密度梯度离心法等。依据是X、Y精子间存在物理性差异f如密度、大小、形态、活力、表面电荷等)。因而缺乏可靠性、重复性和效率性，现已很少使用。目前较准确、较常用的有以下两种方法： 1．1 免疫学分离法
1955年EichvMd等发现．在组织移植试验中．雌性排斥来自基因型相同的雄性移植体．表明雄性存在某种特异的细胞表面抗原[
．命名为雄性特异性弱组织相容性Y 抗原(male specific minorhisto compatibility
Yantigen)。简称H—Y抗原。H—Y抗原特异表达于Y精子细胞膜上。这为利用抗H—Y抗原的抗体，分选H—Y抗原阳性精子
精子1与H—Y抗原阴性精子(x精子)提供了依据[
．引发对精子分离选择和胚胎性别鉴定的广泛研究。除所有异配子型物种的体细胞外，H—Y抗原还表达于多种动物的早期胚胎中fGledhill，1988；Veerhuisetal，1994)。据报道，精液经H—Y抗血清处理后进行人工授精，74％牛犊为雌性；Jones等(1992)将牛精液用H—Y抗原的单克隆抗体处理．再将该抗体的第二抗体所包囊的超磁化多聚体小球加到精子中．将连接磁体的精子除去，结果选出的X精子纯度高达98％，具有较高实用价值。然而。当用流式细胞测定技术检测免疫法分离的X和Y精子时发现X和Y精子与H—Y抗原的结合无显著差异(Hendriksen等．1993)。这表明X和Y精子可能存在相同的抗原．因为它们同源于睾丸内环境。 1．2 流式细胞分类法
研究显示．哺乳动物X和Y精子DNA含量存在差异，如牛3．8％、猪3．6％、马4．1％、羊4．2％、犬3．9％、兔3．0％、粟鼠7．5％、爬行田鼠9．1％～12．5％。因此可利用流式细胞分类仪flow
cytometer)分离X与Y精子用于体外授精。自Johnson等(1989年1首先报道用流动细胞分类仪成功分离兔X和Y精子，并用分离精子授精产下后代，使该技术的研究取得实质性进展。随后，在牛、猪、羊和人都相继取得成功，现已产下数以千计的预选性别后代，成为目前分离精子最可靠的方法。 流式细胞测定技术程序包括精液稀释和荧光染料Hoeschest
33342着色。由于染料可渗入精细胞膜使DNA着色．着色量与DNA量成正比，因此X精子发出的荧光强于Y精子．放射出的荧光信号通过探测器和计算机系统放大分析并分选出X、Y精子。具体方法是：先用DNA特异性染料对精子活体染色．然后使精子连同少量稀释液逐个通过激光束．探测器根据精子的发光强度把电信号传递给计算机，计算机指令液滴充电器使发光强度不同的液滴带不同的电荷．然后通过高压电场，不同电荷的液滴在电场中被分离。用分离后的精子人工授精或体外授精控制性别。 初期流式细胞分类仪分离X与Y精子效率十分低下，且仪器价格昂贵，分离精子经冷冻再解冻后的复苏率比正常冻精偏低，因此很难进入实用阶段。随着流式细胞仪的改进，精子分选效率大大提高。在保持90％纯度的前提下可达1100万个精子／h的分选速度．进一步提高了流式细胞分选技术在精子性别控制中的应用价值。另外，通过将精子直接输送到子宫角、利用微滴培养进行体外授精或胞浆内单精子注射(iCS1)等方法．可克服分选精子效率低的缺点。 2 早期胚胎水平的性别控制
2．1 染色体组型鉴定法
该法是一种经典的胚胎性别鉴定方法。原理是：哺乳动物的核型是固定的．早期胚胎中的一条X染色体暂时失活。因此，可从胚胎中取出少量细胞作染色体分析，鉴别胚胎性别。Hare等(1976)首次尝试用该法鉴定的胚胎移植后获得预期性别的犊牛。若细胞处于分裂中期，染色体铺开良好，检测准确率很高，牛胚胎可达100％。但此法耗时长、重复性差，不适于实际生产。 2．2 免疫学方法
利用H—Y抗血清或H—Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H—Y抗原．从而鉴定出胚胎性别的一种方法
常用问接免疫荧光法检测胚胎H—Y抗原：将胚胎在H—Y抗血清或单克隆抗体中培养，用异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记的第二抗体处理．在荧光显微镜下观察有无特殊荧光，雄性胚胎有荧光，雌性胚胎则无。优点是不损害胚胎且准确率较高。这种雄性特异因子已成为免疫法鉴别多种动物胚胎性别的基础(Ande~on
1987，Wachel 1984，W0od et a1．1988)。
2．3 SRY-PCR 扩增法
SRY基因位于哺乳动物Y染色体短臂上．被认为是TDF的最佳候选基因．而后者是雄性动物睾丸分化的决定因子。目前，SRY基因被广泛用来鉴定胚胎性别。聚合酶链式反应(polymerase
chain
reaction，PCR)方法用于胚胎性别鉴定是通过合成SRY基因片段的寡聚核苷酸片段为引物，在一定条件下进行PCR扩增，经电泳检测扩增结果，能扩增出SRY序列的为雄性，否则为雌性。PCR所需样品无须纯化，样品量少，只要几个细胞就能进行鉴定。该方法的最大问题是污染，因而在操作过程中要严防污染1989年澳大利亚首先成功采用PCR技术在体外扩增牛Y染色体特异DNA片段鉴别奶牛胚胎性别．准确率高达90％以上
1995年欧阳红生等用PCR技术对牛胚胎性别进行鉴定，准确率达到了100％。目前，多重PCR进行胚胎性别鉴定的准确率已达到了95％的水平，并可在2h内完成[
。PCR技术灵敏度高、准确率高、速度快、操作简便，同时避免了其他检测手段耗时长和对胚胎冷冻保存而导致胚胎移植后妊娠率低的弊病，成为目前最常用的胚胎鉴定方法．具有良好的发展前景。 2．4 DNA探针法
该项技术是8O年代发展起来的一种新方法，首先提取被检胚胎的DNA．利用PCR扩增后与用同位素或荧光标记法标记的探针杂交．杂交阳性的为雄性胚胎．阴性的为雌性胚胎。1987年。Leonard等首次报道用牛的雄性特异性DNA探针鉴别牛胚胎性别获得成功。1989年．美国格林纳达遗传公司报道。用制备的3个雄性特异性探针鉴定牛胚胎性别．准确率达到97％～99％。PCR技术与DNA探针的结合．使胚胎性别鉴定方法更为简便、快速、准确；尤其在澳大利亚，用雄性特异DNA序列鉴别牛胚胎性别已渐趋商业化。 3 其他性别控制方法
动物性别控制除了上述途径外．还可通过调节受精环境来实现性别控制。如用化学药品或激素处理精液．或调节动物阴道粘液值。黑木常青(1978)将生理盐水稀释的精氨酸溶液分为高、中、低浓度(分别为10％、5％、2．5％13种，输精前20～30分钟各注入精氨酸液1毫升．结果注入高浓度和中浓度的产雄性多。注入低浓度的产雌性多：李方来(1984)~究了牛阴道粘液值与后代性比的关系．发现酸性环境适宜X精子．当pH>7．6时，Y精子活力较强，后代公犊占66．7％，pH<6．8时，x精子活力较强，后代公犊占37．5％。国内许多关心性别控制的畜牧界人士。围绕精氨酸开展了一些研究．李秀山等(1988)试验结果产母犊率73．9％
．胡春山等(19891为72．2％ ．王瑞山等(1989)为72．4％ ．陈寿南等(1990)为71．7％
。王念功等(1991)为55．1％。
4 影响性别控制技术应用的因素
性别控制技术从出现．发展至今取得了一定成果．但距离实际应用还有一定差距。主要限制因素有：
4．1 成本高
在性别控制过程中往往需要特定的科研仪器，价格十分昂贵，如流式细胞分类仪、显微操作仪、荧光显微镜、PCR仪等，非一般企业所能承受，必须依靠相关科研机构．而这些科研机构和分散的生产企业很难形成迅速的互动关系。目前先进的Lamp法(PCR法的改进方法)，可在一小时内检测出结果。但性别鉴定仪价格约在8万元左右．试剂盒价格在5000～4000元，可供检测24枚胚胎，每枚胚胎的检测成本太高：而且试剂要求在低温条件下长途运输，容易影响效价．使得该技术的推广应用受到限制。 4．2 耗时长
以传统的PCR性别鉴定法为例：采得胚胎后，对胚胎取样；提取胚胎细胞DNA；PCR扩增提取的DNA：最后将扩增后DNA通过琼脂糖电泳鉴别胚胎性别。整个过程约需要数个小时．如果现场不具备实验条件，需送到相关的实验室鉴定。那么耗时将更长。使得鲜胚移植受到限制：若进行胚胎冷冻．解冻后性别鉴定胚胎移植又会降低移植效果 4．3 技术要求高
目前常用的性别鉴定技术f如PCR技术等1往往只能在实验室进行．众多奶牛生产企业不具备实验条件．无法在胚胎移植现场完成。今后应在现有基础上，着重研发快速、准确、经济、实用的胚胎性别鉴定方法．推进性别控制技术的应用进程．促进畜牧业的迅速发展 4．4 准确性与实用性
准确性与实用性是目前各种性别控制方法中普遍存在的问题。有些方法简便易行，但准确性和重复性差．如调节生殖道pH值等。另有些方法如流式细胞分类法和DNA探针法等．准确率很高。可达90％以上：但效率低。实验要求高、耗时长。不适于实际应用。 5 加速性别控制技术应用的建议
5．1
加强科研投入PCR技术应用于胚胎性别鉴定．使性别控制技术进入一个崭新的发展阶段．但须配合简易快速的胚胎取样技术、胚胎性别鉴定试剂盒及取样胚胎的冷冻保存技术等方可达到推广应用阶段。目前市场上已有相关的进口试剂盒出售．但售价太高．应用前景黯淡
故应加强国内自主知识产权性别鉴定试剂盒的研究开发．降低成本．切实推动性别控制技术的应用。相信随着生物技术的飞速发展．这些问题都会妥善解决。 5．2
培养基层技术力量专业技术人员是从事性别控制技术推广的主力军．尤其是基层的中小型企业，专业技术人员严重不足．限制了该项技术推广应用。因此应加强相关专业技术人员培训．采取灵活用人机制．以技术推动生产 5．3
结合相关生物技术性别控制技术不是一门独立的技术，其发展应用必须与其它生物技术(如人工授精、胚胎冷冻、胚胎分割、胚胎移植等1相结合才能在畜牧生产中推广应用．转化为生产力。 5．4
加强教学科研机构与企业的联系教学科研机构是企业的技术后盾。加强教学科研机构和企业的联系．充分利用科研机构的仪器设备，促进产、学、研一体化进程，推动科学技术向生产力的直接转化。 5．5
推动市场化和商业化提高农户对高新技术及潜在应用价值的认识．把眼前利益和长远利益结合起来．扩大性别鉴定胚胎的市场需求：同时性别控制技术要向市场化和商业化过渡。产生规模效应．提高胚胎利用率，降低成本。 在奶牛生产中采用性别控制技术．可显著提高经济收入和生产水平：同时还可增加家畜遗传和表型性别的选择强度，加快遗传进展。当前。在家畜育种中实施的MOET(multiple
ovulation and embryo
transfer)计划缩短了遗传育种进程：结合性别控制技术．将进一步增加选择强度。随着各项生物技术的不断发展。性别控制技术将成为胚胎工程中的一项配套技术．对各项生物技术的发展和应用都具有重要的促进作用。 | 
