牛疾病诊断常用的检验方法

2010-7-29 01:29| 发布者: admin| 查看: 2007| 评论: 0

摘要: 牛尸体剖检时,以无菌操作采取有关组织器官的送检病料的同时，取部分器官组织材料作病原菌的初步检验。　　（一）.病原菌的初步检验常用的检验细菌标本的制作有三种,细菌涂片、血片和组织触片。制片的目的是检查有无 ...

牛尸体剖检时,以无菌操作采取有关组织器官的送检病料的同时，取部分器官组织材料作病原菌的初步检验。
　　（一）.病原菌的初步检验
    常用的检验细菌标本的制作有三种,细菌涂片、血片和组织触片。制片的目的是检查有无细菌存在,是何种形态的细菌。细菌涂片是适用于对细菌培养的形态观察,血片常用于牛羊生前或死后剖检时检查其血液中是否存在细菌。组织触片常适用于死亡牛羊的组织器官的细菌检查。
　　1．标本的制作
    （1）.细菌涂片的制作:取一载玻片,将铂金耳径火焰灭菌后,取1～2铂耳的无菌生理盐水或蒸馏水,放在玻片中央,再将铂耳灭菌,从固体培养基上挑取少许细菌,与玻片上的水点混匀,使其直径约1厘米大小的涂面。涂面要求薄而匀。若是液体培养基则不用加水,直接伸入培养管中挑取1～2铂耳的培养物,放在玻片上,涂成均匀涂面即可。
　　（2）.血片的制作:取一边缘整齐的玻片,用其一端,蘸取血液少许, 在另一玻片上,以45°角度均匀地摊成一条薄的血涂片。
　　（3）.组织触制作:当尸体以无菌手术打开胸腹腔后, 用经火焰灭菌的镊子镊起组织一端,然后用灭菌的剪刀剪下少许组织, 将组织块的切面垂直地在玻片上轻压一下,使留下一组织切面的压迹(每张玻片可作2～3个压迹)。也可将组织用镊子夹住,以切面玻片上以一个方向作一涂层。
　　2．标本的干燥
    玻片涂好后,自然干燥,或将标本面向上,置于酒精灯火焰上方,连续通过2～3次,使其烘干干燥。
　　3．标本的固定
    标本经干燥后,需将其固定,目的使菌体蛋白质凝固在玻片上,不致于染色时被染液或水冲掉。
　　固定有两种:一种为火焰固定,是最常用的方法,即将标本玻片面向上,用姆指和食指拿住玻片的一端,在火焰上方迅速来回通过3～4次,以手背触及玻片,稍感烫手为宜(60℃),这样就固定好了。另一种为化学固定剂,常用的酒精,甲醇 ,丙酮等。即取化学固定剂滴于玻片膜上(要盖满涂面),或将玻片浸在盛有化学固定剂的玻缸内,放一定时间,倾去化学固定剂,用水轻轻冲洗,即可染色。
　　4．标本的染色
    标本固定后,须经染色,未经染色的细菌标本,在显微镜下不易观察。如果加以染色则可清楚地显示菌象。染色除可清楚地看到菌体及其各种结构外,特殊染色法可作为鉴定细菌种类的条件之一。现将常用染液染色法介绍如下:
    (1)吕氏亚甲兰(美兰)染色法:
    染液配制:取亚甲兰饱和酒精溶液30毫升,加入0.01%氢氧化钾水溶液100 毫升,混合即成。
　　染色法:①涂膜标本固定后,滴加染液约2分钟。②水洗,用吸水纸吸干,镜检。③如系切片标本须延长染色5分钟可更久,不用酒精脱色,用苯胺二部苯混合液作为脱水透明,然后,封片镜检,细菌呈蓝色。
　　 (2)革兰氏染色法
    革兰氏染色法是细菌检验中常用,最重要的是一种方法。
　　Jensen's氏涂色改良法:
    染色配制:0.5%结晶紫水溶液,碘溶液(碘1克,碘化钾2克,蒸馏水100毫升) ,复红液(中性红)(中性红1克,1%醋酸2毫升,蒸馏水1000毫升混合)。
　　染色法:①标本制作固定后,加滴结晶紫溶液经半分钟,倾去染液, 滴加碘溶液冲去结晶紫,并保留碘液作用约1分钟。②用95%酒精洗去碘液,并使其脱色,直至涂膜不再有色素析出。水洗。③用中性红溶液复染2～4分钟,水洗, 并用吸水纸吸干。镜检:细菌呈兰紫色的称革兰氏阳性菌,染成红色的称革兰氏阴性菌。
　　Weigert's氏改良法（适用于切片标本）
    染液配制:石炭酸龙胆紫溶液(龙胆紫饱和酒精溶液1份,加5% 石炭酸水溶液10份)。革兰氏碘液(碘1克,碘化钾2克,蒸馏水 300毫升),苯胺二甲苯(苯胺2份,二甲苯1份),稀石炭酸品红溶液(石炭酸品红1份,蒸馏水9份)。
　　染色法:①以石炭酸龙胆紫液染色2～3分钟,倾去染液,滴加革兰氏碘液冲去染液,并作用1分钟,吸干并充分干燥。②用苯胺二甲苯混合液脱色, 直至标本上染色液不再脱下,此时用低倍镜观察,吞噬细胞核为淡紫色。 ③用二苯滴洗并干燥。④稀石炭酸品红复染30秒,水洗后,用吸水纸吸干。镜检, 细菌呈紫色为阳性细菌,呈红色为阴性细菌。
　　瑞特(Wright's)氏染色法
    染液配制:瑞特氏粉剂0.1克在乳体中加甘油3毫升磨研, 并不断加入甲醇 (97毫升)。倾置在棕色玻瓶中,充分摇动使其溶解,经24小时后,过滤应用。暗处保存数月。
　　染色法:①滴加瑞特氏染液,经2～3分钟,使标本为染色中甲醇所固定。②再加约与染液等量的蒸馏水或缓冲液,轻轻摇动玻片或用口气轻轻吹,使其染液混匀,经3～5分钟后,可见玻片液面上显金属闪光。③水洗,不得倾去染液, 必须用水直接冲去染液,以免玻片上存留杂质。干后镜检,细菌呈兰色。
　　姬姆萨氏染色法:
    染液配制:姬姆萨粉剂0.5克,甘油(中性50毫升)在乳钵中研磨,倾入烧瓶内,在55～60℃水溶中加热2小时,使溶化充分,待凉,再加入甲醇50毫升, 静置一日以上,过滤即成贮存之染液。染色前,于每毫升蒸馏水中加原液一滴,即成姬姆萨染液。
　　染色法:①标本干燥后,用甲醇固定3～5分钟。 ②将玻片浸入盛有染色液的染色缸中,染色30分钟或染色数小时,取出水洗,干后镜检,细菌呈兰青色,视野常呈红色。
　　荚膜染色法(Hiss's氏)
    染液配制:龙胆紫饱和酒精溶液1份,加蒸馏水19份。20%硫酸铜水溶液。
　　染色法:①标本涂膜宜薄,常加热固定,将染液滴加玻片上, 微微加热玻片至出现蒸气,并保持蒸气状约20秒钟(或不加热延长时间2分钟),水洗。②再用 20%硫酸铜溶液冲洗,干燥后镜检,菌体呈紫色,荚膜呈淡兰色。
　　碱性美兰染色法:①将已干燥的玻片上滴加甲醇,固定3～5分钟,倾去甲醇液,水洗。②滴加碱性美兰染色液滴于玻片上,染2～3分钟,水洗,干后镜检, 菌体呈紫色,荚膜呈淡兰色。
　　抗酸染色法:
    ①在已干燥固定好的玻片上, 滴加多量的石炭酸复红染色液,在玻片下以酒精灯火焰微微加热至发生蒸汽为度,持续至标本无色脱出为止,充分水洗。②再用碱性美兰复染约1分钟,水洗。干后镜检。抗酸性细菌呈红色,非抗酸性细菌呈兰色。
　　鞭毛染色法:
    染液配制:用钾明矾或亚明矾的饱和水溶液20毫升,20%鞣酸水溶液10毫升 ,蒸汽馏水10毫升,95%酒精15毫升,碱性复红饱和酒精液3毫升。各液混合,置于紧塞的玻瓶中,保存期为一周。
　　染色法:①滴染液于标本玻片上,在温暖处染色10分钟。②水洗,干后镜检 ,鞭毛呈红色,菌体亦为红色。
　　芽胞染色法:
    ①在已干燥固定的玻片上,滴加5%铬酸水溶液,处理2～5分钟,水洗,用吸水纸吸干。②滴加石炭酸复红液,加温染色2～3分钟,冷却后, 水洗。③用2%盐酸酒精脱色5～10秒,水洗。④滴加碱性美兰复染1～3分钟,水洗 ,干燥后,镜检,芽胞呈红色,菌体呈兰色。
　　提示:经病原菌初步检验后,如果怀疑该菌属于某种类型细菌时,或者必要时,可做进一步检查,参照微生物学中有关内容进行细菌分离培养和鉴定或作血清学检查(略)。
　　（二）、寄生虫的检验
    当牛发病后,生前或死后,怀疑寄生虫病时,要进行寄生虫病原的初步检查:
     1．血液原虫检查:
    基本过程：采血→涂片→固定→染色→冲洗→镜检。
　　（1）.采血:于耳尖采血部位消毒后,用针直接刺入0.3～0.5mm,然后挤压使其出血。
　　（2）.涂片:取洁净的载玻片2张,从取血部位刮取血少许,用推片的方法制成血膜。用一片进行活体检查,另一片固定后染色用。
　　（3）.固定:滴加瑞特氏染液数滴,(其中有甲醇)约30秒～1分钟。
　　（4）.染色:加上等量缓冲液或蒸馏水,轻摇载片,或口气轻轻吹动, 使水和梁色液混匀,约3～5分钟分钟后,用自来水由一端冲洗。
　　（5）.晾干:用油镜检查虫体。
　　2．虫卵的检查:
    检查粪便中的寄生虫卵,常有大量的粪便残渣、酵母菌、霉菌、花粉、植物纤维、油滴等,常与虫卵混淆,要进行分离与鉴别, 一般常采用直接涂片法,厚涂法,浓缩法,沉淀法和浮聚法，将虫卵集中，显微镜检查。
　　