牛病毒性腹泻病毒及其进化研究进展

牛病毒性腹泻病毒及其进化研究进展

郭　燕^1,2，王新华²，钟发刚²

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000；2.新疆农垦科学院畜牧所基因工程实验室，新疆石河子 832000) 

摘　要：牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus，BVDV)在我国发现有20多年，而在世界范围来讲已有近100年的历史。由于牛病毒性腹泻病毒造成奶牛生产性能下降、繁殖障碍、持续感染等，是导致集约化奶牛场严重亏损的重要原因。且牛病毒性腹泻导致的黏膜病致死率几乎100%，已经严重阻碍养牛业的发展，但目前我国对牛病毒性腹泻还没有好的防控措施。文章对牛病毒性腹泻的发生历史总结，便于在牛病毒性腹泻病毒的诊断和预防中参考。

关键词：牛病毒性腹泻病毒；进化；进展 

在20世纪80年代和90年代，以出血综合征和剧烈的急性腹泻暴发为特征的病毒性疾病的出现，使牛病毒性腹泻的经济意义正在逐渐增加。由于“新”毒株的出现，使当前对该病变化基本的诊断方法、疫苗及其致病机理必须认真考虑。

1　牛病毒性腹泻的临诊症状和病理变化

20世纪40年代，在加拿大西部，首次报道一种未知起源感染牛的疾病“X病”，被描述为两种形式，即亚急性型和急性型^[1]。有人认为亚急性型已经在该地区存在好多年，在一个畜群里有1头～2头动物被感染并死亡，几周内不会再出现进一步感染；急性型感染幼畜，病程7 d～10 d，以死亡为转归。成年牛感染表现为更剧烈的症状，3 d～4 d死亡。临床症状包括发热，水样和血样腹泻，里急后重，脱水，呼吸急促，心动过速，双耳无力下垂，食欲减退，多涎，流鼻涕，鼻腔、鼻口及唇口腔黏膜溃疡，最初的报道还有描述腹股沟、会阴区、耳朵和大腿内侧皮肤的损伤。

尽管不清楚是否所有的损伤在每头感染动物上都被典型观察到，在鼻腔和气管观察到的病变，也贯穿上下消化系统。前胃通常不受影响，皱胃上皮几乎完全脱落。消化道损伤越远端越以溃疡为特征。在肾脏的皮质、输尿管和肿大的淋巴结内有出血点。本病以血容量减少和血凝时间缩短为重要特点。

康耐尔大学(Cornell University)的临床医生和科学家1946年报道了当年春季和夏季在牛群中暴发的“新”病^[2]，在加拿大西部也有相似的报道。这种“新”病以急性腹泻、沉郁、食欲减退和口腔溃疡为特征，临诊表现与剖检发现和在萨斯喀彻温省(Saskatchewan)报道的“X”病是一致的。然而，奥拉夫(Olafson)等在纽约限制使用“X”病这一术语，尽管慢性病程相似，特征为衰弱，皮肤干厚，舌、上腭和消化道扩散性的损伤，胆囊和胆管增厚，导致高死亡率。此病易感染的本性是通过给牛接种感染严重的牛排泄混合物得到证实，这头被接种病毒的牛不会感染，3周后，这个畜群的其他牛会被感染。后来，康耐尔大学的研究人员利用严重感染动物的脾脏研磨液和血液复制此病。在一些动物，发热是伴随流涎和鼻液增多出现的。严重感染动物会出现腹泻、脱水和虚弱。腹泻症状(大约10 d)出现3 d后，出现口腔溃疡。没有死亡的病例，口腔溃疡很快就会痊愈。在严重感染的牛剖检时发现和那些“X”病的描述一致。这个可复制的病，被称为牛的病毒性腹泻(BVD)。

在1950年，爱荷华州的牧场主开始经历他们以前从未观察到在牛上的一种疾病，尽管爱荷华州立大学的兽医看到和BVD相似，但他们相信这是一种不同的疾病^[3]，原因有：①流出的鼻液是脓性的而不是黏液性的；②在接下来几年内该病没有重复出现在同一个牧场内；③通过非肠道注射血液、组织抽提液、脑脊液，试图在牛上复制此病，结果只出现轻微的发热。他们将这种病定义为黏膜病(MD)。

在1957年，研究人员从MD病例中分离并且培养出病毒^[4]，这种病毒在培养的细胞上可致细胞病变(CPE)，能引起象空泡和细胞死亡的形态改变。在同一年，康耐尔大学的研究人员从典型的BVD病例中发现一种非致细胞病变(nCP)的病毒。在当时，这两种分离病毒之间的关系是未知的。

3年后，康耐尔大学的研究人员在俄勒冈州BVD病例上分离出CP型病毒，这种命名为Oregon C24V的病毒接种牛后，出现的临床症状和BVD相似，并且抗体能够抑制BVD病毒(BVDV)的CP型和nCP型两种型^[6]。为了阐明这些新病毒的性质和他们之间的关系，当时研究人员的任务是对标准毒株物理性质(例如超滤性质，沉降系数的浮力密度)和抗原性质的研究。一个关键的发现来自典型MD或BVD病牛的血清在CP型病毒的细胞培养上能中和CP型病毒。研究人员认为，不仅在物理和抗原性质上MD和BVD病毒相似，而且这些病毒和猪瘟病毒相关[现在是指古典猪瘟病毒(CSFV)]^[7]。

1961年，CP型BVD病毒株Oregon (C24V)在细胞上传代致弱(32次)^[8]。这种致弱的Oregon病毒成为第一个商业BVD病毒疫苗。这种改良的活病毒疫苗广泛应用于预防后来多种并发症，包括疫苗导致的MD、繁殖障碍和先天缺陷^[9]。

到20世纪60年代末，最初被描述为“X”病的已经迅速增长成病毒病的型谱，并一致认为BVD和MD已经出现^[10]。MD被描述为导致犊牛低发病率高病死率(病死率几乎100%)。没有证据表明MD是传染性的。研究人员用分离的CP型病毒设法复制MD，结果表现出类似温和的BVD症状。相似的病变可考虑认为BMD和BVD是有微小变化的同一种病(尽管没有科学的证据)^[10]。

在20世纪60年代和70年代，探究牛病毒性腹泻-黏膜病(BVD-MD)的发病机理，集中于实验感染，尤其是在怀孕牛和新生牛上。子宫内感染牛病毒性腹泻病毒，发现出现流产和各种各样的畸形。这些试验也使我们理解为新生牛先天感染低量的BVDV，通常这样的牛不会活过几个月，最终死于先前描述的慢性MD^[11]。这些低量的BVDV发现于持续感染(PI)牛上。最重要的是这些持续感染牛出现免疫异常，尤其是不能产生BVDV的抗体^[12]。健康公牛持续感染nCP型BVDV两年以上，明显缺少病毒抗体，是BVDV持续感染的进一步阐明。

将BVDV接种于怀孕58 d～125 d的血清学反应阳性的牛和怀孕42 d～114 d的血清学反应阴性的牛，产出临床正常的牛即使能分离出BVDV的PI牛，这些牛对任何BVDV保持完全的血清学反应阴性，甚至用同一种病毒加强接种这些PI牛也不会产生抗体。发现PI牛是有免疫活性的，因为它能中和其他感染病毒的抗体，例如传染性牛鼻气管炎病毒和副流感病毒-3，黏着溶血性巴氏杆菌抗体^[14]。在PI牛上缺少BVDV抗体的关键是子宫感染BVDV免疫系统发育，所以发育中的免疫系统误将BVDV认为是自身的，不能产生BVDV的抗体。只有nCP型病毒能产生PI牛。尽管CP型病毒能通过胎盘，但仍不能产生PI牛。另外，nCP型BVDV比CP型BVDV更容易引起流产^[14-17]。

现在已能够复制MD，可以制定更多的计划与BVD进行有效的比较，发现CP型和nCP型结合可以引起比CP型或nCP型病毒单独感染更严重的疾病。双重感染引起的实验性疾病类似于自然发生的MD。

在20世纪80年代末，牛病毒性腹泻病毒被分类为瘟病毒属，连同边界病毒(BDV)和古典猪瘟病毒(CSFV)同属于黄病毒科。严重的临床疾病，并且由BVDV引起的严重组织损伤，被指定为MD。相反，温和的病症伴随最小程度临床变化，并分离到nCP型BVDV的称为BVD。nCP型BVDV的重要意义被认为只是作为病毒的储存库，仅在感染怀孕牛时有害。认为在有免疫活性的动物上二次感染是不可能的。

如上所述，根据MD致病机理，说明nCP型BVDV引起重大疾病的可能被忽视。然而，在20世纪80年代末，在成年牛和犊牛，与nCP型BVDV有关的严重出血症(没有伴随的CP型BVDV)在几个国家均有报道^[20-22]。这种BVD出血症以发热为特点，血小板显著减少，导致血性腹泻，鼻出血，在黏膜表面淤血和渗出性出血，注射点出血等^[22-23]。在暴发时分离株(isolate 890)作为参考型和参考序列^[24-25]。

1993年，在北美洲五大湖区^[26]、加拿大魁北克^[27]和英格兰^[28]暴发了临诊症状和MD相似的疾病，呼吸道疾病和腹泻是最普遍的最初症状，口腔病病变常发生于老年牛，畜群死亡率平均为25%^[26]。根据先前报道的出血症，这次暴发严重的BVD应该归因于nCP型BVDV，而不是CP型/nCP型联合引起的MD。

2　在瘟病毒属中的进化关系

考虑到BVDV毒力的分类或评价决定性的方法，回顾瘟病毒属基因组的自然本性非常重要。瘟病毒是无节段的、单一的RNA病毒，现在归属于黄病毒科。黄病毒科有3个属，即黄病毒属、瘟病毒属和类C型肝炎病毒属。BVDV基因组包括一条长的开放阅读框(ORF)，两端有两个非编码区(UTR)。这个ORF翻译成一条长的多肽，后来由病毒和细胞蛋白酶分裂成病毒蛋白质。除了第一个蛋白质Npro(这是一种病毒蛋白酶)，BVDV的基因组是由结构蛋白基因组成的(衣壳蛋白和糖蛋白)，在5′ORF末端和非结构蛋白基因(NS)占据ORF最后2/3。在非致细胞病变病毒基因组中有6种非结构蛋白(NS2/3、4A、4B、 5A和5B)。BVDV基因的名称和数目和其他瘟病毒、黄病毒和类C肝炎病毒基因一致，有相似的基因序列。

3　RNA病毒中基因变异的重要性

表型多样的差异性，例如抗原的变异，传染性和复制率，能够影响病毒的毒性，归属于基因组的分类、变异或者再结合。变异可能是个别核苷酸一个点的变异(改变或缺失)，也可能是基因的一个片段的缺失。在RNA病毒中，核苷酸一个位点的变异非常普遍，当病毒的聚合酶不能校正或修复复制过程中的错误，就象DNA编码有机体那样。当多个位点发生变异时，将不改变氨基酸或合成蛋白质的功能，核苷酸的缺失也会发生^[29]。这种病毒依赖其他的BVDV提供缺少的结构蛋白，才具有传染性。

再结合可能发生在宿主和病毒之间，导致宿主的RNA序列插入到病毒基因组或被重排、复制或病毒基因核苷酸序列两者都有。任何事件表明额外的内部蛋白酶裂解位点的产生是导致p80(NS3)蛋白产生的原因。这个裂解的蛋白质与BVDV细胞培养致细胞病变有关^[29]。当突变出现在nCP型BVDV持续感染动物上时，变异的病毒(CP型)数量增多，除了表面上相同的病毒，CP型和nCP型同时存在于宿主体内，正是这一特殊性导致所谓的MD。有人认为不管MD是否在动物出生后几周或几个月内出现，在遗传改变型的不同是明确的^[31]。早期或晚期发作的MD致病机理的不同，在临床案例已被阐明。

病毒多样性的机制对它的进化和最终的病毒存活可能是有利、有害、或者不相关的。对病毒最重要的改变是提高或增强它们的复制、生存或两者兼有。对宿主最重要的是改变病毒的毒力或宿主专一性。

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