髓过氧化物酶检测奶牛隐性乳房炎研究进展

　　摘 要：奶牛隐性乳房炎的检测方法有多种，相比之下，近年来，国外报道的用检测奶样中髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）来诊断奶牛隐性乳房炎的方法更符合快速、简便、高灵敏度、高特异性的现代诊断方法要求。根据乳房炎过程中的生理生化指标的变化特点，可得出奶液中MPO是乳房炎指示物。奶样中的体细胞数（SCC）和MPO浓度的相关系数值为0.91，奶样中随着SCC的增高，MPO的水平也增高达到2 000 ng/mL，同时也可分离到大量细菌。免疫学分析MPO单克隆抗体与奶液中成分乳铁蛋白、乳过氧化物酶、牛血清白蛋白、MPO、淋巴细胞、少量体细胞的乳样之间ELISA反应没有交叉性，表明MPO分子在乳房炎中具有很高的特异性。通过对牛奶中MPO的检测来判断乳房内中性粒细胞（PMN）的活性状态，可对奶牛隐性乳房炎做出早期诊断。

　　关键词：奶牛；隐性乳房炎；髓过氧化物酶；检测

奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业的主要疾病之一，不仅影响奶牛的产奶量，且严重时使奶牛淘汰。据报道，国外奶牛乳房炎的发病率约为20%～60%，美国每年因奶牛乳房炎引起的直接经济损失超过20亿美元，而国内奶牛乳房炎的发病率大约是20%～70%，每年造成的直接经济损失超过21亿人民币。据资料记载，临床型乳房炎占奶牛总发病数的21%～23%，其淘汰牛占奶牛总淘汰数的9%～10%。奶牛隐性乳房炎流行面广，为临床型乳房炎的1 540倍，引起产奶量降低4%～10%，使奶质降低，并易转变为临床型乳房炎。因此，研究一种方便快捷、特异性好、可推广使用的检测方法，对患乳房炎的奶牛乳汁进行检测并做出早期诊断，对减少奶牛业经济损失具有重要意义^[1]。

国内外奶牛隐性乳房炎的检测方法有体细胞计数（SCC）检测法^[2]、手握式导电仪检测法^[3]、凝固酶试验(TCT)、单克隆抗体的免疫方法^[4]、DNA指纹图技术检测法^[5]、PCR检测法等，这些方法在我国奶牛养殖现状均很难得到广泛的应用，且许多方法需在专业实验室才能完成，这对推广应用是不利的，有些方法在临床应用时不能够快速、简便地做出诊断。应用先进的ELISA试剂盒和试纸条技术来检测奶牛隐性乳房炎是一个快速简便的诊断思路。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）可作为奶牛隐性乳房炎的指示性物质，可以通过MPO的研究对奶牛隐性乳房炎的检测上升到分子水平。目前，国内还未见关于奶牛乳房炎的MPO研究报道，瑞典的国家兽医研究所于1994年报道了奶液中MPO是乳房炎的指示性酶类物质，并制备了奶牛MPO的单克隆抗体，建立了针对牛乳中MPO的MPO-ELISA方法。

1 乳房炎的发病机理

乳房炎是一种复杂的疾病，其病原菌很多，它的发生是病原、机体防御功能和外界环境因素共同作用的结果。葡萄球菌和链球菌占乳房炎病原菌总数的90%以上，是引起奶牛隐性乳房炎的主要病原菌。病原菌数中所占的比例依次为停乳链球菌(40.91%)、金黄色葡萄球菌(27.28%)、无乳链球菌(13.64%)、乳房链球菌(9.09%)、大肠埃希菌 (9.09%)。此外，支原体、病毒等也可引起奶牛隐性乳房炎^[6]。

奶牛患乳房炎时体内白细胞凭借其渗出性、变形性、趋化性及吞噬功能等生理特性而杀灭乳腺组织中或乳房中的病原体。多形核中性白细胞（PMN）、巨噬细胞和单核细胞能包围和吞噬入侵有机体的微生物，被激活后的白细胞释放两种颗粒，含有MPO及弹性酶的嗜苯胺篮体^[7]（初级颗粒）和含有乳铁素的特异颗粒（次级颗粒）。MPO及乳铁素主要参与依赖氧的杀菌活动^[8]，乳铁素为氧自由基的产生提供绝大部分的铁。乳房炎时，一些蛋白酶类^[9]，如过氧化物酶、凝固酶、C-反应蛋白、间质金属蛋白酶（MMP2、MMP9）^[10]，都存在于乳房炎症部位和乳汁中，乳腺上皮细胞脱落增加。

2 MPO是奶牛乳房炎的指示物

奶牛的MPO是PMN、单核细胞、巨噬细胞释放的嗜天青颗粒的主要成分，并在炎症过程中扮演了吞噬和溶菌的重要角色，成熟的牛MPO是一种亚铁血红素糖蛋白，它的结构是四聚体，两重链大小分别为60 ku，两轻链分别为15 ku，牛MPO的分子质量为150 ku。已经确定的牛MPO有3种形式，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，MPO在哺乳动物体内抵抗微生物作用已得到证实。用一种特异的ELISA方法检测牛奶中MPO来诊断乳房炎，对此瑞典的Cooray R做过精确的评估，ELISA用了两种特异性抗体，MPO单克隆抗体（McAb）和MPO多克隆抗体，共对141份奶样的体细胞数和ELISA检测MPO浓度得出的相关系数值为0.91。奶中MPO的ELISA结果显示具有很高的敏感性和特异性，敏感性的变异总和为10%，结果较为理想。由此判断奶中的MPO稳定性很好；85%的奶样中随着MPO浓度增加分离的微生物的量也提高；在没有体细胞或很少的乳样中ELISA没有检测出MPO，有90%样品没有分离出微生物，结果清楚地说明，分析乳汁中MPO的量，就可以确定奶牛是否患隐性乳房炎^[10]。

2.1 MPO浓度与吸光值的关系

研究用的牛MPO是经过精确测定了吸收光谱^[11]、多肽亚单位结构、氨基酸组成和过氧化物酶活性的标准品。通过方格板滴定分析McAb最适浓度和最适培养浓度，MPO的检测浓度范围为2 ng/mL～1 000 ng/mL（以经纯化的MPO作为标准^[12]）,在波长405 nm的吸光度随MPO浓度的增大吸光值也增加，而且数据图表显示近似于直线关系。由此说明，MPO作为奶牛乳房炎的指示物具有可检测性。

2.2 乳汁中MPO和其他成分的ELISA反应交叉性

McAb与乳铁蛋白(LF)、乳过氧化物酶(LPO)、牛血清白蛋白(BSA)、MPO、淋巴细胞(Lym)、PMN、少量体细胞的乳样之间的ELISA反应没有交叉性。McAb与纯化的MPO和从PMN中提取的MPO的反应能力很高。实验数据充分表明，MPO与McAb-ELISA之间具有很高的特异性，而且7种物质与MPO-ELISA交叉反应性很低。

2.3 奶样中MPO的浓度和SCC的相关性

在不同SCC的奶样中用ELISA检测其中的MPO含量，得出牛奶中的MPO与SCC的散点图和回归分析表明，奶样中MPO的浓度和体细胞数SCC具有正相关关系，r＝0.91。分析证明了奶样中SCC能作为隐性乳房炎诊断依据，同样奶样中的MPO含量的高低也可作为隐性乳房炎的诊断依据，且具有很规律的正相关性。

2.4 奶样中的SCC、MPO浓度与分离的细菌量的关系

研究表明，奶样中随着SCC的增高，MPO的水平也增高到2 000 ng/mL，在SCC和MPO浓度都高的奶样中都可以分离到细菌，其中葡萄球菌占52％，乳房链球菌占32％，埃希菌属占6％。感染细菌奶样中的SCC和MPO含量明显增多，从而可以证明，当乳腺感染细菌引起乳房炎时，奶液中的SCC和MPO指标在一定限度内升高。这个指标为检测奶样中MPO量来诊断奶牛乳房炎提供了依据。

研究表明，用MPO-ELISA检测牛奶中的MPO是一个方便可行的诊断乳房炎的方法。奶牛患乳房炎时趋动到炎症感染部位的PMN会释放吞噬颗粒酶MPO，通过测量奶样中MPO的含量和活性，发现乳汁中MPO的水平是诊断乳房炎的很好指标。MPO-ELISA检测奶样中MPO的量和奶样中PMN数增多的相关分析，得出奶样中MPO与体细胞数SCC的相关系数r＝0.91，乳汁中其他颗粒酶与SCC的相关性都比MPO低。说明MPO在乳房炎奶汁中具有很高特异性，同时发现根据MPO浓度可以估计SCC的最低量为100 000个/mL。

3 McAb的特异性

1994年，Ruby  C等利用杂交瘤技术制备了奶牛MPO的McAb，并对其的特异性、灵敏度、稳定性都做了研究和分析。其实验中从奶牛血清中的PMN中提取的MPO经过纯化作为免疫小鼠的抗原，用提纯的MPO包被ELISA微量滴定板检测小鼠产生的McAb的特异性，用快速G蛋白琼脂糖凝胶纯化McAb，对小鼠McAb的亚型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM分别进行了测定，也测定了McAb的等电点^[13]。

国外曾有学者制备了8株McAb的B细胞交杂瘤细胞AM1-AM8,它们都与MPO 3种色谱层析试验结果相似，通过MPO McAb建立ELISA和免疫印迹反应测定血清中和乳汁中的MPO，并通过ELISA方法阐述了奶牛McAb的特异性和敏感性，McAb与PMN的其他颗粒酶无交叉反应性。4种McAb亚型AM1 AM2 AM3 AM4所占比例很大。McAb与MPO的任一位点或抗原决定簇结合都会影响MPO的活性作用。用化学发光反应法对McAb抑制纯化好的奶牛MPO（50 ng/mL）活性的能力检测。AM1、AM2、AM3和AM4 4株MPO McAb对MPO活性都有抑制效果。在浓度为100 ng/mL时McAb的化学发光值减少30%～50%，不同株McAb的抑制效果不同。研究还证明同种型的单克隆抗体之间不会互相影响其活性。

McAb只与PMN特异性反应，不与淋巴细胞和上皮细胞反应，试验数据显示McAb与MPO的3种形式反应特异性均很高，与牛乳铁蛋白（BLF）、牛乳过氧化物酶（BLPO）和BSA不发生反应。研究表明，McAb可以检测奶牛乳腺炎时的MPO含量和活性，据此可以对奶牛隐性乳房炎做出早期诊断。

4 展望

目前，国内已报道了在医学临床上应用抗MPO抗体的ELISA检测脉管炎和肾炎^[14]，McAb在急性白血病鉴别诊断中的应用^[15]，胶乳凝集法（LAST）与酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗MPO抗体??^[16]，乳胶凝集法检测MPO抗体等研究情况。国内外也有许多关于MPO活性检测在人的消化系统疾病诊断时的应用^[17-18]。

在临床兽医学领域，针对目前我国奶牛隐性乳房炎的高发病率和诊断技术相对落后的现状，根据MPO在隐性乳房炎奶牛的乳汁中具有高特异性和可检测性的特点^[19],通过制备奶牛McAb，建立MPO-ELISA检测试剂盒和检测试纸条，直接检测奶样对奶牛隐性乳房炎的早期快速诊断方法是完全可行的。此外，将上述检测方法应用于其他哺乳动物的炎症性疾病检测中^[20]，相信也将同样会具有广阔的空间和发展前景。

      参考文献（略）

　　作者简介：郭昌明(1980-),男，内蒙古集宁人，硕士，主要从事动物营养代谢病与中毒病研究