兰州地区奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

魏小娟，蒲万霞，周绪正，张继瑜，李金善，李剑勇，牛建荣

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050)

摘　要：采集临床型乳房炎患牛的乳样进行细菌分离鉴定，并选择主要病原菌做药敏试验，对兰州地区部分奶牛场乳房炎发生情况进行调查。结果表明，主要致病菌为葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌，这些细菌对环丙沙星、氟哌酸和氟嗪酸等药物均高度敏感。

关键词：奶牛乳房炎；病原菌；分离鉴定；药敏试验 

奶牛乳房炎是危害奶牛养殖业最常见的疾病之一，该病可使奶牛泌乳机能受损，生殖机能失调，从而引起产奶量下降，乳品质量发生改变，延长产后发情和妊娠时间，甚至使病牛失去生产性能，造成严重的经济损失，而且危害人类健康。乳房炎主要由150多种非特定的病原微生物引起，不同区域乳房炎的细菌分布和种类均有差异^[1]。

近年来，兰州地区的个体奶牛养殖业发展很快，但由于饲养管理水平差，疾病防治技术落后，奶牛乳房炎经常发生。又因滥用抗生素的现象十分普遍，造成许多病原微生物产生耐药性，给乳房炎的治疗带来困难^[2]。为了掌握奶牛乳房炎病原的流行情况，以便更好地防治该病，对兰州市部分地区乳房炎患牛进行病原菌的分离与鉴定，并测定分离细菌的药物敏感特性，筛选出敏感的抗菌药物，为兰州地区奶牛乳房炎的有效防治提供科学的依据。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　乳样采集　乳样采自兰州伏龙坪奶牛场、兰州桃树坪奶牛场、兰州古城坪奶牛场患临床型乳房炎的奶牛。奶牛按常规挤奶消毒程序，先用温水冲洗乳房，然后用1 mL/L新洁尔灭清毒，最后用750 mL/L酒精消毒乳头和采样人员的手指。每个乳头弃去前3～4把奶，然后以无菌操作方法，每个乳室取奶样约10 mL于灭菌小瓶中，加盖封紧，标明牛号、乳室、日期，随即置于附有冰袋的采样箱内，立即送检。

1.1.2　培养基及试剂　50 mL/L绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、普通琼脂培养基按常规方法配制^[3]。生化鉴定所用的微量发酵管及药敏试纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3　药敏纸片　氟哌酸、氟嗪酸、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星、丁胺卡那霉素、林可霉素、克林霉素、先锋霉素V、青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、卡那霉素、强力霉素、四环素、链霉素、新霉素，均由杭州天和微生物试剂有限公司生产。

1.2　方法

1.2.1　细菌分离培养　将无菌采集的乳样充分摇匀，分别划线接种于普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基，置37 ℃温箱培养24 h后观察菌落形态特征，挑取典型菌落涂片，革兰氏染色，镜检。根据菌体形态、溶血情况及染色特性初步判定细菌类属^[4]。并将其进一步纯化培养。纯培养后镜检无杂菌者保存于试管斜面培养基内，按有关生化鉴定方法进行生化鉴定。

1.2.2　细菌的鉴定

1.2.2.1　球菌的鉴定　镜检形态符合葡萄球菌特性，在普通营养琼脂和血液琼脂平板形成圆形、金黄色、灰白色或柠檬色菌落，且接触酶试验、凝固酶试验阳性的细菌，即鉴定为金黄色葡萄球菌。镜检形态符合链球菌特性，且接触酶试验阴性细菌，即鉴定为链球菌属细菌。若细菌CAMP试验阳性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为无乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为停乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为乳房链球菌。

1.2.2.2　杆菌的鉴定　革兰氏阴性杆菌氧化酶试验阴性，在麦康凯琼脂平板形成粉红色，在伊红美蓝琼脂平板形成紫黑色带金属光泽菌落，在三糖铁琼脂培养产酸或产气，不分解尿素，VP试验阴性的细菌即鉴定为大肠埃希菌。革兰氏阴性细菌的普通肉汤培养物呈黄绿色，在营养琼脂平板形成黄绿色菌落，且有芳香气味，在伊红美蓝兰琼脂上呈现灰色菌落，且氧化酶试验阳性，能分解葡萄糖的细菌即鉴定为绿脓杆菌。

1.2.3　药敏试验　采用药物纸片琼脂扩散法^[5]，将分离菌纯化后进行药敏试验，方法是将分离菌均匀涂布于普通琼脂平板表面(链球菌需鲜血琼脂平板)，然后贴上药敏纸片，置于37 ℃温箱中培养18 h，测定抑菌圈直径，依据药敏片判定标准，确定细菌的药物敏感性。

2　结果

2.1　细菌分离鉴定结果

对12份阳性乳样进行细菌分离培养和鉴定，有11个乳样检出5种共26株细菌。其中葡萄球菌16株；无乳链球菌4株；大肠埃希菌4株，停乳链球菌1株；乳房链球菌1株。而另一个强阳性乳样则未检出细菌，可能为非特异性乳房炎或者是由其他病原微生物引起。

2.2　药敏试验结果

对不同乳样的主要病原菌进行药敏试验，结果表明，葡萄球菌对氟哌酸、氟嗪酸、环丙沙星、庆大霉素、恩诺沙星和丁胺卡那霉素高度敏感，对林可霉素、克林霉素和先锋霉素V比较敏感，而对青霉素则基本耐药；乳房链球菌对氟哌酸、氟嗪酸、氨苄青霉素、环丙沙星、恩诺沙星、阿莫西林和青霉素均高度敏感；无乳链球菌除对卡那霉素、强力霉素和四环素不敏感、对丁胺卡那霉素、链霉素、恩诺沙星和新霉素敏感外，对其他药物均高度敏感。大肠埃希菌对氟哌酸、氟嗪酸、林可霉素、庆大霉素、环丙沙星和恩诺沙星较敏感。综合分析以上结果可见，所分离到的5种细菌对环丙沙星、氟哌酸和氟嗪酸均高度敏感，可作为治疗临床型奶牛乳房炎的首选药物。

3　讨论

所采的12份乳样中，有1份未检出细菌，其可能的原因为：①非特异性乳房炎或者是其他病原微生物感染引起。②因用药物治疗，乳中有抗生素而查不到细菌；③奶牛本身的防御机能清除了乳腺中的病原体，但组织损伤尚未修复，导致牛奶中的体细胞含量仍维持在较高水平。

引起奶牛乳房炎的主要原因是感染病原微生物，其中以金黄色葡萄球菌和链球菌为主，约占奶牛乳房炎病原菌的90%以上^[6]，试验中金黄色葡萄球菌和链球菌所占的比例为84.6%。周庆国等报道，临床型乳房炎中链球菌的检出率远远高于其他致病菌，其中以无乳链球菌为主，而试验中所检出的细菌以葡萄球菌为主。

从试验结果可以看出，这3个牛场患临床型乳房炎的病牛，其病原菌中金黄色葡萄球菌的分离率相对较高，链球菌的分离率较低。其中大部分病例的乳样中都是2种或2种以上菌共同存在。由于区域不同，时间不同或饲养环境的不同等原因，病畜所感染的病原微生物种类也不尽相同。试验为乳房炎的预防和治疗提供及时可靠的依据，减少不必要的损失。

药敏试验结果表明，奶牛乳房炎的主要病原菌中绝大部分对青霉素和链霉素耐药，但对环丙沙星、氟哌酸和氟嗪酸等敏感，这与在治疗奶牛乳房炎方面较少使用这些药物有关。随着抗菌药物的广泛应用和耐药菌株的增多，细菌对常用抗生素的耐药性愈来愈强，这不仅给奶牛乳房炎治疗的选择用药带来很大困难，而且这些耐药基因可以在各菌株、动物和人类之间传播，给人类用药带来很大问题。

参考文献（略）

收稿日期：2007-04-10

基金项目：兰州市科技资源整合行动计划项目(15-1-27)

作者简介：魏小娟(1977－)，女，甘肃天水人，硕士，主要从事微生物学研究。