奶牛隐性乳房炎致病菌的微生物学鉴定方法概述

林　源¹，何生虎¹，薛忠儒²，李生虎¹，王志昇¹，王建东¹

(1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021； 2.宁夏中宁县大战场乡畜牧站，宁夏中宁 751102)

摘　要：引起奶牛乳房炎的病原微生物很多，包括细菌、病毒、真菌、支原体四大类，其中葡萄球菌、链球菌占病原菌的90%～95%。文章就金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(CO)、牛棒状杆菌(CB)、其他菌(OTH)的微生物学快速检测方法做一介绍。这些方法能够把葡萄球菌、链球菌和其他细菌鉴别开来，并能通过试验判定其具体类型，简便易行，费用较低，实用性强，适合牛场推广应用。

关键字：奶牛隐性乳房炎；致病菌；鉴定

　奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疾病，目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。普通的检测方法只能根据检测出病原菌的种类、数量大致判断是否发生乳房炎，而且用生化鉴定管进行鉴定至少需要28 h才能确诊，费时、费力、检测速度慢^[1-2]。但乳汁的微生物检测可以确定感染动物病原微生物的具体种类，从而为临床治疗提供可靠依据，其他方法多不具有此特点。本文主要介绍了在送检乳样经细菌分离培养后，如何通过菌落特性、染色镜检和生化试验快速、简便地鉴定出乳样所含致病菌的具体种类。

1　材料与准备

1.1　主要材料与试剂

50 mL/L绵羊红细胞琼脂板，CMT试剂，兔血浆，七叶苷药敏片(Esculin片)，灭菌蒸馏水，无水乙醇，β溶血性金黄色葡萄球菌，无乳链球菌(用于CAMP试验)。

1.2　七叶苷药敏片的制备

首先是制备灭菌圆纸片，采用直径为6 mm的纸片作抗生素药敏试验，用铝箔包裹，灭菌器灭菌(121 ℃，15 min)。其次是配置药液，蒸馏水100 mL、蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、七叶苷0.1 g、柠檬酸铁0.05 g，煮沸2次以完全溶解，置灭菌器灭菌15 min。最后将灭菌过的圆纸片置入灭菌的玻璃皿中，溶液倾至器皿中，弃去多余液体，用干热灭菌器烘干(55 ℃，2 d)，取出制备的药敏片放入冰箱备用^[3]。

2　菌种鉴定试验方法及原理

2.1　菌落特征

葡萄球菌为中等大小、清晰白色或黄色菌落，链球菌为小型、无色、湿润、隆起、半透明菌落^[4-5]。葡萄球菌有4种溶血类型，即完全溶血，不完全溶血，双重溶血和不溶血。链球菌有3种溶血类型，即绿色溶血，完全溶血和不溶血。

2.2　革兰氏染色特征

葡萄球菌镜检所见类似于葡萄串状蓝色球状菌，链球菌呈长链或短链蓝色的球状或卵圆形；大肠埃希菌菌体呈红色短杆状，牛棒状杆菌菌体呈红色棒状^[6-7]。

2.3　接触酶试验

用于链球菌和葡萄球菌的区分。在载玻片上滴一滴30 mL/L过氧化氢液，挑取单个菌落在过氧化氢液中搅匀。阳性者产生气泡，阴性者无反应^[8-9]。

2.4　氢氧化钾试验

用于葡萄球菌和大肠埃希菌的区分。在载玻片上滴1滴30 g/L KOH溶液，挑取细菌菌落与之混合均匀，大肠埃希菌混合液在5 s～30 s内会变成黏稠状。阳性者混合物变成黏稠状或胶胨样，阴性者混合物仍然保持液状。

2.5　CAMP-Esculin test

鉴定链球菌，需要用CAMP试验对所有链球菌的菌落进行检查。将β溶血性金黄色葡萄球菌中央划线接种于50 mL/L绵羊红细胞琼脂板，挑取琼脂板上的1个～2个菌落，在β溶血性金黄色葡萄球菌接种线5 mm外垂直划线。每次试验均应包括已知的无乳链球菌培养物，作为CAMP阳性对照^[3,10-11]。

如果CAMP试验阳性，再将Esculin片放至接种划线的中间区域，30 min后观察结果。如果Esculin片中心的颜色由白色变成黑色或棕色，则为Esculin阳性。CAMP阳性、Esculin水解阴性的，是无乳链球菌(SAG)，其他反应则是其他链球菌(OS)。

CAMP阳性：箭头状的完全β溶血，是由金黄色葡萄球菌产生的溶血区域。

CAMP阴性：无反应。

Esculin水解阳性：颜色由白变成黑色或棕色。

Esculin水解阴性：无反应(保持白色不变)。

2.6　凝固酶试验

凝固酶试验用于区分金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌^[8]。将0.5 mL含凝固酶的兔血浆连同24 h培养的葡萄球菌平板培养物接入试管中，将试管放入37 ℃培养箱培养24 h。阳性者轻轻扣击试管，就可出现凝固现象。阴性者培养24 h后，仍然呈液体状态。

3　试验过程

3.1　样品采集与处理

在挤奶时间采集挤后奶样用于培养。采集用于培养的乳样之前，清洁和干燥乳头很重要。所有乳样必须以正确的方式采集，污染乳样没有任何检验价值。乳样必须采自用单个纸巾擦干、采样前用700 mL/L酒精棉球用力擦拭过的干净、干燥的乳头，之后采集乳样。乳区乳样每个乳头采集2.5 mL，用乳头消毒液浸泡乳头。样品采集后，将取样试管放在试管架上，以便运往实验室。乳样应当放置在用冰块降温至5 ℃的便携式冷藏箱中送往实验室。

3.2　样品的微生物学鉴定

引起奶牛乳房炎的致病菌包括金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(EC)、牛棒状杆菌(CB)、其他(OTH)。

图1标明了鉴定这些致病菌的实验操作过程，非常方便亚临床乳房炎致病菌的鉴定，使用材料少，成本低、时间短。亚临床乳房炎致病菌鉴定的基本要点是菌落的特征。葡萄球菌为小至中等大小清晰白色或黄色菌落，链球菌为小型无色、湿润、隆起、半透明菌落。

如果凭菌落特征不能区分葡萄球菌(Staphylococci)和链球菌(Streptococci)，那么接触酶试验结果非常方便区分。如果凭菌落特征也不能区分大肠埃希菌(EC)和葡萄球菌(Staphylococci)，则可用KOH试验结果非常方便区分。葡萄球菌的接触酶试验为阳性，而链球菌的接触酶试验为阴性；大肠埃希菌的氢氧化钾试验为阳性；凝固酶阴性葡萄球菌的氢氧化钾试验为阴性。

金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(EC)、牛棒状杆菌(CB)、其他(OTH)。

Staphylococcus aureus(SA)，Coagulase-negative Staphylococci(CNS)， Streptococcus agalactiae(SAG)，Streptococcus canine(SC)， Other Streptococcus(OS)，Escherichia coli(EC)，Corynebacterium bovis(CB) and other(OTH)。

图1　亚临床乳房炎致病菌鉴定的实用程序

Fig.1　practical procedures of Subclinical mastitis pathogen identification

4　小结

许多乳房炎致病菌有时能够从奶牛生活的环境中分离到，因而如果发现5个以上同样大小和颜色的菌落，就可做出明确诊。对于葡萄球菌，如果仅发现1个菌落，对诊断也有重要意义。混合感染并不常见，如果乳区乳样中经常发现2种或更多种细菌，那么有可能取样方法不正确^[12]。

培养20 h后，观察培养结果。此时能够观察到的几乎都是革兰氏阳性球菌，所以，必须按照菌落的大小、颜色来区分葡萄球菌、链球菌，很少能检测到大肠埃希菌，因为如果大肠埃希菌侵入乳腺，就会迅速繁殖并出现临床症状。培养20 h尚不能检测到牛棒状杆菌，要检测牛棒状杆菌，培养时间应在36 h以上。

健康、正常乳腺的未污染乳样不含有细菌。当乳区乳样出现3种或更多种不一致的菌落，那么这个乳样最有可能已被污染，该乳样也应该按污染乳样记录。

参考文献（略）

收稿日期：2007-06-14

作者简介：林 源(1982－)，男，宁夏人，硕士研究生，主要从事动物营养代谢与中毒病研究。