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奶牛隐性乳房炎致病菌的微生物学鉴定方法概述

2010-7-29 02:01| 发布者: admin| 查看: 1794| 评论: 0

摘要: 林 源1,何生虎1,薛忠儒2,李生虎1,王志昇1,王建东1 (1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021; 2.宁夏中宁县大战场乡畜牧站,宁夏中宁 751102)摘 要:引起奶牛乳房炎的病原微生物很多,包括细菌、病毒、真菌、支原 ...

 

林 源1,何生虎1,薛忠儒2,李生虎1,王志昇1,王建东1

(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021 2.宁夏中宁县大战场乡畜牧站,宁夏中宁 751102)

摘 要:引起奶牛乳房炎的病原微生物很多,包括细菌、病毒、真菌、支原体四大类,其中葡萄球菌、链球菌占病原菌的90%95%。文章就金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(CO)、牛棒状杆菌(CB)、其他菌(OTH)的微生物学快速检测方法做一介绍。这些方法能够把葡萄球菌、链球菌和其他细菌鉴别开来,并能通过试验判定其具体类型,简便易行,费用较低,实用性强,适合牛场推广应用。

关键字:奶牛隐性乳房炎;致病菌;鉴定

 奶牛乳房炎是引起奶牛业经济损失的一种重要疾病,目前还没有快速、特异检测奶牛乳房炎主要致病原的方法。普通的检测方法只能根据检测出病原菌的种类、数量大致判断是否发生乳房炎,而且用生化鉴定管进行鉴定至少需要28 h才能确诊,费时、费力、检测速度慢[1-2]。但乳汁的微生物检测可以确定感染动物病原微生物的具体种类,从而为临床治疗提供可靠依据,其他方法多不具有此特点。本文主要介绍了在送检乳样经细菌分离培养后,如何通过菌落特性、染色镜检和生化试验快速、简便地鉴定出乳样所含致病菌的具体种类。

1 材料与准备

1.1 主要材料与试剂

50 mL/L绵羊红细胞琼脂板,CMT试剂,兔血浆,七叶苷药敏片(Esculin),灭菌蒸馏水,无水乙醇,β溶血性金黄色葡萄球菌,无乳链球菌(用于CAMP试验)

1.2 七叶苷药敏片的制备

首先是制备灭菌圆纸片,采用直径为6 mm的纸片作抗生素药敏试验,用铝箔包裹,灭菌器灭菌(121 ℃15 min)。其次是配置药液,蒸馏水100 mL、蛋白胨1 g、氯化钠0.5 g、七叶苷0.1 g、柠檬酸铁0.05 g,煮沸2次以完全溶解,置灭菌器灭菌15 min。最后将灭菌过的圆纸片置入灭菌的玻璃皿中,溶液倾至器皿中,弃去多余液体,用干热灭菌器烘干(55 ℃2 d),取出制备的药敏片放入冰箱备用[3]

2 菌种鉴定试验方法及原理

2.1 菌落特征

葡萄球菌为中等大小、清晰白色或黄色菌落,链球菌为小型、无色、湿润、隆起、半透明菌落[4-5]。葡萄球菌有4种溶血类型,即完全溶血,不完全溶血,双重溶血和不溶血。链球菌有3种溶血类型,即绿色溶血,完全溶血和不溶血。

2.2 革兰氏染色特征

葡萄球菌镜检所见类似于葡萄串状蓝色球状菌,链球菌呈长链或短链蓝色的球状或卵圆形;大肠埃希菌菌体呈红色短杆状,牛棒状杆菌菌体呈红色棒状[6-7]

2.3 接触酶试验

用于链球菌和葡萄球菌的区分。在载玻片上滴一滴30 mL/L过氧化氢液,挑取单个菌落在过氧化氢液中搅匀。阳性者产生气泡,阴性者无反应[8-9]

2.4 氢氧化钾试验

用于葡萄球菌和大肠埃希菌的区分。在载玻片上滴130 g/L KOH溶液,挑取细菌菌落与之混合均匀,大肠埃希菌混合液在5 s30 s内会变成黏稠状。阳性者混合物变成黏稠状或胶胨样,阴性者混合物仍然保持液状。

2.5 CAMP-Esculin test

鉴定链球菌,需要用CAMP试验对所有链球菌的菌落进行检查。将β溶血性金黄色葡萄球菌中央划线接种于50 mL/L绵羊红细胞琼脂板,挑取琼脂板上的1个~2个菌落,在β溶血性金黄色葡萄球菌接种线5 mm外垂直划线。每次试验均应包括已知的无乳链球菌培养物,作为CAMP阳性对照[3,10-11]

如果CAMP试验阳性,再将Esculin片放至接种划线的中间区域,30 min后观察结果。如果Esculin片中心的颜色由白色变成黑色或棕色,则为Esculin阳性。CAMP阳性、Esculin水解阴性的,是无乳链球菌(SAG),其他反应则是其他链球菌(OS)

CAMP阳性:箭头状的完全β溶血,是由金黄色葡萄球菌产生的溶血区域。

CAMP阴性:无反应。

Esculin水解阳性:颜色由白变成黑色或棕色。

Esculin水解阴性:无反应(保持白色不变)

2.6 凝固酶试验

凝固酶试验用于区分金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌[8]。将0.5 mL含凝固酶的兔血浆连同24 h培养的葡萄球菌平板培养物接入试管中,将试管放入37 ℃培养箱培养24 h。阳性者轻轻扣击试管,就可出现凝固现象。阴性者培养24 h后,仍然呈液体状态。

3 试验过程

3.1 样品采集与处理

在挤奶时间采集挤后奶样用于培养。采集用于培养的乳样之前,清洁和干燥乳头很重要。所有乳样必须以正确的方式采集,污染乳样没有任何检验价值。乳样必须采自用单个纸巾擦干、采样前用700 mL/L酒精棉球用力擦拭过的干净、干燥的乳头,之后采集乳样。乳区乳样每个乳头采集2.5 mL,用乳头消毒液浸泡乳头。样品采集后,将取样试管放在试管架上,以便运往实验室。乳样应当放置在用冰块降温至5 ℃的便携式冷藏箱中送往实验室。

3.2 样品的微生物学鉴定

引起奶牛乳房炎的致病菌包括金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(EC)、牛棒状杆菌(CB)、其他(OTH)

1标明了鉴定这些致病菌的实验操作过程,非常方便亚临床乳房炎致病菌的鉴定,使用材料少,成本低、时间短。亚临床乳房炎致病菌鉴定的基本要点是菌落的特征。葡萄球菌为小至中等大小清晰白色或黄色菌落,链球菌为小型无色、湿润、隆起、半透明菌落。

如果凭菌落特征不能区分葡萄球菌(Staphylococci)和链球菌(Streptococci),那么接触酶试验结果非常方便区分。如果凭菌落特征也不能区分大肠埃希菌(EC)和葡萄球菌(Staphylococci),则可用KOH试验结果非常方便区分。葡萄球菌的接触酶试验为阳性,而链球菌的接触酶试验为阴性;大肠埃希菌的氢氧化钾试验为阳性;凝固酶阴性葡萄球菌的氢氧化钾试验为阴性。

金黄色葡萄球菌(SA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)、无乳链球菌(SAG)、犬链球菌(SC)、其他链球菌(OS)、大肠埃希菌(EC)、牛棒状杆菌(CB)、其他(OTH)

Staphylococcus aureus(SA)Coagulase-negative Staphylococci(CNS) Streptococcus agalactiae(SAG)Streptococcus canine(SC) Other Streptococcus(OS)Escherichia coli(EC)Corynebacterium bovis(CB) and other(OTH)

1 亚临床乳房炎致病菌鉴定的实用程序

Fig.1 practical procedures of Subclinical mastitis pathogen identification

4 小结

许多乳房炎致病菌有时能够从奶牛生活的环境中分离到,因而如果发现5个以上同样大小和颜色的菌落,就可做出明确诊。对于葡萄球菌,如果仅发现1个菌落,对诊断也有重要意义。混合感染并不常见,如果乳区乳样中经常发现2种或更多种细菌,那么有可能取样方法不正确[12]

培养20 h后,观察培养结果。此时能够观察到的几乎都是革兰氏阳性球菌,所以,必须按照菌落的大小、颜色来区分葡萄球菌、链球菌,很少能检测到大肠埃希菌,因为如果大肠埃希菌侵入乳腺,就会迅速繁殖并出现临床症状。培养20 h尚不能检测到牛棒状杆菌,要检测牛棒状杆菌,培养时间应在36 h以上。

健康、正常乳腺的未污染乳样不含有细菌。当乳区乳样出现3种或更多种不一致的菌落,那么这个乳样最有可能已被污染,该乳样也应该按污染乳样记录。

 

 

参考文献(略)



收稿日期:2007-06-14

作者简介: (1982),男,宁夏人,硕士研究生,主要从事动物营养代谢与中毒病研究。


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