新疆克拉玛依地区奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定

(1.新疆农业大学动物医学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆克拉玛依市农牧业科学技术研究所，新疆克拉玛依  834000)

摘　要：用兰州乳房炎检测试剂(Lanzhou mastitis test，LMT)对克拉玛依规模化奶牛场进行了奶牛隐性乳房炎流行病学调查。结果显示，该地区奶牛隐性乳房炎的发病率为70.43%(543/771)。对543份阳性牛乳样品进行了病原菌的分离鉴定，结果发现，阳性乳样品中细菌分离率达89.13%(484/543)，葡萄球菌、链球菌、肠杆菌和棒状杆菌为主要致病菌，且多为几种致病菌的混合感染。

关键词：隐性乳房炎；致病菌；分离鉴定；奶牛

奶牛乳房炎是奶牛生产中最常见的四大疾病之一，给奶牛业造成巨大的经济损失^[1­2]。牛奶制品中携带的病原菌也会给人类的健康构成威胁^[3­4]。虽然国内外的学者都在积极寻找有效措施来控制奶牛乳房炎，但成效不大，尤其是奶牛隐性乳房炎(又称亚临床乳房炎)病因复杂，隐蔽性强，更是一个亟待解决的难题。据报道，美国、日本的奶牛隐性乳房炎发病率为62.1%^[5]，而我国为50%～80%，并呈上升趋势^[6­8]。由此可见，我国奶牛隐性乳房炎的感染率高于世界发达国家的平均水平。奶牛乳房炎是一种多病因性疾病，分为三种疾病决定子，即病原、环境以及宿主。为了预防奶牛乳房炎，已经采用了许多较为先进的模型，例如五要点计划，使隐性乳房炎显著减少^[9]。新疆克拉玛依地区规模化奶牛场规模较大，设施较为先进。对场内发生的显性乳房炎曾采用不同方法治疗，但因一些耐药菌株的出现，未能达到令人满意的效果。由于缺乏奶牛隐形乳房炎以及优势致病菌种类的资料，给防控带来了困难。该文在奶牛隐性乳房炎流行病学调查基础上，分析该地区优势致病菌的种类，以寻求最佳的控制途径。

1　材料与方法

1.1　试验用动物

被检泌乳期奶牛771头，来自新疆克拉玛依地区规模化奶牛场所属3个奶牛养殖基地。

致病性试验动物为昆明系小鼠，雌雄对半，体重20 g～22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2　仪器、试剂及培养基

兰州奶牛乳房炎检测试剂(LMT)，批号20050325，购自中国农科院畜牧与兽医研究所药厂。

生化鉴定用微量发酵管，购自杭州天和微生物试剂有限公司。葡萄球菌生化微量鉴定管(凝固酶、硝酸盐还原、麦芽糖、蕈糖、甘露糖、木糖、蔗糖、核糖、乳糖、果糖、甘露醇、木糖醇、尿素酶)，批号20051028；链球菌生化鉴定管(血清菊糖、甘露醇、乳糖、棉子糖、葡萄糖、水杨素、蕈糖、淀粉、明胶、七叶苷、65 g/L高盐肉汤、美蓝牛奶、马尿酸盐、pH 9.6肉汤、CAMP)，批号20051020；肠杆菌生化微量鉴定管(分解葡萄糖产气、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、靛基质、甲基红、枸椽酸盐、硫化氢、尿素、运动力)，批号20050618。50 mL/L绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂、普通琼脂、营养肉汤、血清肉汤、沙堡弱氏葡萄糖等生化培养基及试剂按常规方法配制^[10]。

其他常规实验室器材由新疆农业大学兽医病理研究室提供。

1.3　隐性乳房炎的检测及乳样采集

用温水清洗乳房，2 mL/L新洁尔灭消毒乳房，用750 mL/L的酒精溶液消毒乳头，带灭菌手套进行人工挤乳，弃去前三把乳汁^[11]，分别将4个乳区2 mL左右的乳汁挤入相应的乳汁检验盘中，倾斜加入1∶3稀释的LMT试剂2 mL，水平晃动，使乳汁与检测试剂充分混合，10 s后观察，并判定结果。阴性(0～20万个体细胞数)混合物呈液状，盘底无沉淀物；可疑(15万～50万个体细胞数)混合物呈液状，少量絮状物，摇动后消失；弱阳性(40万～100万个体细胞数)有明显絮状物或沉淀产生；阳性(80万～400万个体细胞数)絮状物或沉淀黏稠不易流动；强阳性(350万个以上体细胞数)混合物几乎完全形成胶状不能流动。

选取LMT检测阳性牛，以无菌操作采集每个乳头的奶样品10 mL，置无菌小玻璃瓶中加盖，标明牛号、乳室、日期，送检。经LMT普查、筛选，共采集隐性乳房炎阳性乳样品543份，供实验室细菌分离与鉴定。

1.4　乳样品的细菌分离

以无菌操作将每份乳样品分成3小份，分别做真菌、需氧菌和厌氧菌的分离培养。

1.4.1　真菌的分离培养　将一小份乳样品直接接种于含有青、链霉素的沙堡弱氏葡萄糖斜面培养基上，置37 ℃温箱中培养，每天观察1次，连续3周无菌落生长者可判为阴性，如长出菌落，需逐日观察菌落形态及颜色变化，以确定是否为真菌。

1.4.2　需氧菌及厌氧菌的分离培养　将其余2小份乳样品初次培养分别接种于血清肉汤，置恒温箱和厌氧罐中，37 ℃ 增菌培养16 h～24 h后，观察细菌在肉汤中的生长情况，进行初步的涂片、染色、镜检，并做好记录。将初次厌氧培养物再划线接种于50 mL/L绵羊鲜血琼脂培养基上，置于厌氧罐中培养24 h～48 h；初次培养的需氧培养物用无菌小棉签或接种环分别接种于50 mL/L绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基和普通琼脂培养基，并做好标记，置于恒温箱培养16 h～24 h，挑选单菌落做纯化培养，并涂片进行革兰氏染色，镜检^[11]。

1.5　细菌鉴定

根据细菌培养特性、染色形态特征，将分离到的细菌初步分为G^＋ 球菌、G^－球菌、G^＋ 杆菌、G^－杆菌四类，确定其生化反应和其他鉴定项目。

1.5.1　G^＋球菌　接触酶试验阳性者，应用葡萄球菌生化微量鉴定管进行鉴定，接触酶试验阴性者，做链球菌生化鉴定^[12]。

1.5.2　G^－杆菌　乳糖试验阳性者，应用肠杆菌生化微量鉴定管进行鉴定。乳糖试验阴性者，可根据菌落生长情况和MR试验阴性者确定为绿脓杆菌，阳性者可能为变形杆菌，归于肠杆菌^[13]。

1.5.3　G^＋ 杆菌　镜检观察，菌体分支的可初步定性为诺卡氏菌属，菌体不分支的为棒状杆菌^[10,14]，并可进一步做接触酶等生化试验给予定性。

1.5.4　G^－球菌　经革兰氏染色、镜检表明，本次试验无G^－球菌。

1.6　动物致病性试验

取纯化菌株培养24 h的血清肉汤培养物以0.5 mL/只的剂量，给健康小鼠腹腔注射，每个菌株为1组，每组接种10只小鼠，并设对照组接种等量血清肉汤，观察2 d，记录小鼠活动及死亡情况，剖检患病或死亡小鼠，观察病变，并挑取有病变的内脏器官直接涂片镜检。

2　结果

2.1　流行病学调查结果

在被检的771头无临床症状的泌乳牛中，检出患有隐性乳房炎的牛为543头，占总数的70.43%，各分场乳样品阳性检出率见表1。

表1　各奶牛分场乳房炎阳性检出率

Table 1　Detecting rate of the mastitis in each branch dairy farm